PKM2在肝細(xì)胞癌惡性演進(jìn)中的作用及其臨床意義.pdf

1、目的：分析PKM2在肝細(xì)胞癌惡性進(jìn)程中的動態(tài)表達(dá)及其生物學(xué)行為及功能，探討其參與肝細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的機(jī)制及其在臨床病理學(xué)診斷、治療及判斷預(yù)后的意義。
　　材料和方法：采用二乙基亞硝胺誘癌建立大鼠肝癌模型，觀察誘癌過程中大鼠肝組織學(xué)變化及PKM2的動態(tài)表達(dá)情況。選取2000年1月至2005年12月在解放軍總醫(yī)院行手術(shù)切除的肝細(xì)胞癌病例，共345例，獲得隨訪信息302例。免疫組化檢測PKM2、p53及ki-67在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)，分析各基

2、因表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系及各基因表達(dá)之間的相關(guān)性；Kaplan-Meier生存分析分析PKM2表達(dá)的預(yù)后意義；COX風(fēng)險模型分析各臨床病理特征及基因表達(dá)的預(yù)后意義。2010年～2011年間手術(shù)切除的新鮮肝細(xì)胞癌及癌旁肝組織標(biāo)本20例，提取總蛋白及RNA,Westernblot檢測PKM2蛋白的表達(dá)，實時定量PCR法檢測miR-199a-3p的表達(dá)，分析其表達(dá)的差異性。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞CmiR-199a-3p與PKM2調(diào)控關(guān)系。

3、進(jìn)一步通過軟瓊脂克隆形成實驗、侵襲轉(zhuǎn)移實驗等的實驗研究，觀察miR-199a-3p與PKM2對肝癌細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化、增殖及遷移能力的影響及對肝癌細(xì)胞周期的影響；通過藥物敏感實驗檢測PKM2及miR-199a-3p在HepG2細(xì)胞對順鉑藥物敏感性的作用。
　　結(jié)果：1.在二乙基亞硝胺誘導(dǎo)的肝癌大鼠模型中免疫組化顯示PKM2的表達(dá)隨肝細(xì)胞癌的形成逐漸由細(xì)胞漿向細(xì)胞核轉(zhuǎn)移，到后期出現(xiàn)胞漿胞核均表達(dá)。
　　2.345例HCC免疫組化結(jié)

4、果顯示PKM2的表達(dá)定位于胞核和/或胞漿，PKM2在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)顯著高于癌旁組織（P=0.000）；其陽性表達(dá)與組織學(xué)分級（P=0.000）、TNM分期(P=0.000)、脈管癌栓(P=0.000)、包膜侵犯(P=0.048)、術(shù)前淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.005)及肝內(nèi)轉(zhuǎn)移(P=0.000)正相關(guān)；與血清AFP水平（P=0.009）正相關(guān)；與P53(P=0.039)及Ki67(P=0.000)的表達(dá)正相關(guān)；還與性別相關(guān)，女性明顯高于男性

5、(P=0.003)。除此之外，PKM2在HCC中的核表達(dá)還與腫瘤大小(P=0.029)及脂肪變性的程度(P=0.021)相關(guān)。KM生存分析顯示PKM2高表達(dá)者預(yù)后差。COX回歸模型分析顯示腫瘤大小(p=0.018)、腫瘤數(shù)目(p=0.019)、TNM分期(p=0.007)和PKM2的胞漿表達(dá)(p=0.018)為獨立預(yù)后因素。
　　3.Westernblot顯示17/20例肝細(xì)胞癌中PKM2蛋白高表達(dá)（P=0.0075），RT-PC

6、R顯示20/20例肝細(xì)胞癌中miR-199a-3p顯著下調(diào)(P=0.0001)。
　　4.PKM2是miR-199a-3p的靶基因。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炞C實，miR-199a-3p可以直接作用于PKM2的3′UTR區(qū),過表達(dá)miR-199a-3p可以顯著抑制HepG2細(xì)胞中內(nèi)源PKM2蛋白的表達(dá)。
　　5.PKM2通過miR-199a-3p的負(fù)調(diào)控可抑制HepG2細(xì)胞的克隆形成及肝細(xì)胞生長因子（Hepatocytegrow

7、thfactor，HGF）誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞系的侵襲轉(zhuǎn)移。
　　6.PKM2參與細(xì)胞周期的調(diào)控，將細(xì)胞周期阻滯在G0-G1期。
　　7.在HepG2細(xì)胞中干涉PKM2及轉(zhuǎn)染miR-199a-3p可增加其對順鉑的藥物敏感性。
　　結(jié)論：1).PKM2參與肝細(xì)胞癌的生物學(xué)進(jìn)程，具有對肝細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化能力，并能促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移；2）PKM2的入核發(fā)生在肝細(xì)胞癌的中后期，表達(dá)部位的差異可作為惡性轉(zhuǎn)化的指征；3).PK