膿毒癥AKI時(shí)腎組織細(xì)胞凋亡及與TLR4-9通絡(luò)關(guān)系的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、急性腎損傷(acute kidney injury,AKI)是危重患者的一常見臨床問題,并且是不良預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,重癥患者AKI的發(fā)生率為36％,雖然AKI的病因是多因素的,但膿毒癥一直是其首要原因,AKI的病因50％以上是膿毒癥,而且膿毒癥AKI患者的病死率要明顯高于非膿毒癥AKI患者?；仡櫧?0年來(lái),雖然在重要臟器支持及復(fù)蘇手段方面取得了一些進(jìn)步,但膿毒癥相關(guān)AKI的發(fā)病率和病死率仍居高不下,主要原因是其病理生理機(jī)制尚不十分清楚

2、。
　　 傳統(tǒng)的觀點(diǎn)認(rèn)為腎的缺血/低灌注即腎血流動(dòng)力學(xué)的改變是膿毒癥AKI的主要發(fā)病機(jī)制,其所導(dǎo)致的腎小管上皮細(xì)胞壞死是膿毒癥AKI的主要病理生理機(jī)制,并通過(guò)補(bǔ)液治療和應(yīng)用血管活性藥物來(lái)增加平均動(dòng)脈壓,恢復(fù)腎血流,改善腎功能,但是,此觀點(diǎn)受到爭(zhēng)議,因?yàn)榇擞^點(diǎn)多來(lái)自腎缺血和藥物損傷動(dòng)物模型的研究結(jié)果,與臨床膿毒癥不相符,而且目前沒有隨機(jī)對(duì)照實(shí)驗(yàn)來(lái)支持這個(gè)觀點(diǎn),而更多的研究證實(shí):膿毒癥AKI時(shí)腎血流實(shí)際上是增加的,腎皮、髓質(zhì)的血流分

3、布是沒有變化的。所以,腎的低灌注在低動(dòng)力血流動(dòng)力學(xué)狀態(tài)下可能是重要的,但是,在液體復(fù)蘇后、高動(dòng)力持續(xù)進(jìn)展的膿毒癥AKI中,可能不是關(guān)鍵性的;而且現(xiàn)有的,包括動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究均不能證明腎小管壞死是膿毒癥AKI的主要病理表現(xiàn)。隨著研究的深入,學(xué)者們發(fā)現(xiàn)腎組織細(xì)胞凋亡可能是AKI主要病理生理機(jī)制,而不僅僅是壞死,如腎毒性物質(zhì)甘油—AKI、缺血再灌注—AKI以及內(nèi)毒秦—AKI,但是目前國(guó)內(nèi)外有關(guān)“腎細(xì)胞凋亡”在多種微生物感染膿毒癥性AKI(人

4、類最常見的膿毒癥性AKI)中作用的研究還很少,還需要進(jìn)一步研究探討。
　　 病原微生物進(jìn)入機(jī)體,導(dǎo)致腎細(xì)胞凋亡,引起AKI,此過(guò)程很復(fù)雜,最重要的問題是:哪些受體識(shí)別這些細(xì)菌,然后怎樣啟動(dòng)并保持炎癥反應(yīng)、怎樣引起凋亡呢?roll樣受體(ton like receptors,TLRs)的發(fā)現(xiàn)使我們對(duì)此理解發(fā)生了革命性的變化。TLRs存在于固有免疫系統(tǒng)和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)細(xì)胞上,提供了病原體和生物相互作用的界面,了解其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和它們

5、復(fù)雜的調(diào)節(jié)機(jī)制對(duì)于理解膿毒癥復(fù)雜的表象很有意義。TLRs不僅存在于免疫系統(tǒng),也存在于組織和器官,如心臟、腎臟、肝臟等,而且TLRs可以與內(nèi)源性非微生物物質(zhì)相互作用的事實(shí)使我們對(duì)這些分子的理解又增加了復(fù)雜性。目前國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)有關(guān)TLRs在膿毒癥性AKI中作用的報(bào)道很少,存在爭(zhēng)議。小RNA干擾(small interference RNA,siRNA)是近年研究證明的一種基因沉默技術(shù),具有高度序列專一性,能有效沉默特定基因的表達(dá),且方法簡(jiǎn)單可

6、行。
　　 基于以上問題,本系列研究通過(guò)建立與臨床膿毒癥密切相關(guān)的膿毒癥模型一盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)(cecal ligation and puncture,CLP),制備多菌感染膿毒癥AKI小鼠模型,應(yīng)用動(dòng)物和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、病理形態(tài)學(xué)、生物化學(xué)、酶聯(lián)免疫吸附法、流式細(xì)胞術(shù)、分子生物學(xué)等方法探討膿毒癥AKI小鼠模型制備,并分別應(yīng)用選擇性caspase-3抑制劑、TLR4/9 siRNA預(yù)防性干預(yù),觀察對(duì)腎組織細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)、腎功能及預(yù)后

7、的影響,研究和探討腎組織細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)、TLR4/9在膿毒癥AKI中的作用并進(jìn)行膿毒癥AKI機(jī)制探討,以期為臨床預(yù)防和治療膿毒癥AKI提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。
　　 本課題五部分的具體內(nèi)容如下:
　　 第一部分膿毒癥AKI小鼠模型制備
　　 目的:探討一種簡(jiǎn)單易行、重復(fù)性好,且接近臨床的AKI動(dòng)物模型的制備方法。
　　 方法:健康清潔級(jí)雄性C57BL/6小鼠68只,隨機(jī)分為假手術(shù)(sham組)和模型組

8、(CLP組,盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)組)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求,二組均在制模后設(shè)置6h、12h、24h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)組,每組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)組8只小鼠,檢測(cè)血內(nèi)毒素水平、進(jìn)行血培養(yǎng),檢測(cè)血肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)濃度,光鏡、電鏡下觀察腎組織病理學(xué)改變,每組余10只小鼠觀察生物學(xué)行為變化(包括精神、皮毛色澤、飲食、活動(dòng)等)及4天、7天存活率。計(jì)量資料以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差(-x±s)表示,二組間比較采用t檢驗(yàn),多組間比較采用LSD單因素方差分析,應(yīng)用Kaplan-Me

9、ier法計(jì)算累計(jì)生存率并繪制生存曲線,生存曲線的比較采用log-rank檢驗(yàn)。
　　 結(jié)果:
　　 1血內(nèi)毒素水平:CLP組較sham組顯著升高(P＜0.05);血培養(yǎng):sham組為陰性,CLP組可檢出大腸桿菌、變形桿菌、假單胞菌屬和少量格蘭陽(yáng)性球菌。
　　 2 Sham組小鼠各項(xiàng)生物學(xué)行為很快恢復(fù)正常,CLP組小鼠制模后6～12h表現(xiàn)為明顯的早期膿毒癥特征,持續(xù)至48～72h。
　　 3 CLP組,6h

10、Cr較sham組顯著升高(P＜0.05),12h后開始下降,與sham組沒有顯著性差異(P＞0.05),但仍高于sham組:BUN各時(shí)間點(diǎn)均顯著高于sham組(均P＜0.05)。
　　 4 CLP組腎組織病理?yè)p傷評(píng)分各時(shí)間點(diǎn)均顯著性高于sham組(均P＜0.05)。
　　 5 Sham組制模后4天、7天小鼠全部存活,CLP組4天、7天病死率分別為50％、80％,二組比較有顯著性差異(P＜0.05)。
　　 小結(jié):

11、CLP小鼠血內(nèi)毒素濃度明顯增高、血培養(yǎng)陽(yáng)性,且為多種細(xì)菌的混合感染,伴有遠(yuǎn)隔臟器—腎臟功能受損及腎臟組織病理?yè)p傷,不伴有壞死現(xiàn)象,證明膿毒癥AKI模型制備成功。CLP誘導(dǎo)的多菌感染膿毒癥AKI模型是簡(jiǎn)單且可復(fù)制的。
　　 第二部分腎組織細(xì)胞凋亡在膿毒癥AKI小鼠中的作用及選擇性caspase-3抑制劑預(yù)防性干預(yù)的研究
　　 目的:探討腎組織細(xì)胞凋亡在腹腔多種微生物感染膿毒癥誘發(fā)急性腎損傷(AKI)中的作用,以及選擇性ca

12、spase-3抑制劑預(yù)防性應(yīng)用的作用。
　　 方法:健康清潔級(jí)雄性C57BL/6小鼠102只,隨機(jī)分為假手術(shù)組(sham組)、模型組(CLP組,盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)組)和半胱氨酸蛋白酶(caspase)-3抑制劑組(CI組,CLP術(shù)前30min給予caspase-3特異性拮抗劑Ac-DEVD-CHO,4μg/g腹部皮下注射)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求,三組均在制模后設(shè)置6h、12h、24h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)組,每組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)組8只小鼠,檢測(cè)血肌酐(Cr)

13、、尿素氮(BUN)濃度,用流式細(xì)胞術(shù)和TUNEL法檢測(cè)腎組織細(xì)胞凋亡,實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)腎組織caspase-3mRNA表達(dá),免疫組化法檢測(cè)caspase-3在腎臟的表達(dá),觀察小鼠腎組織病理學(xué),每組余10只小鼠觀察生物學(xué)行為變化及4天、7天存活率。計(jì)量資料以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差(-x±s)表示,多組間比較采用LSD單因素方差分析,多個(gè)獨(dú)立樣本非參數(shù)檢驗(yàn)采用Kruskal-Wallis H檢驗(yàn),采用Kaplan-Meier法計(jì)算累計(jì)生存率并

14、繪制生存曲線,生存曲線的比較采用log-rank檢驗(yàn)。
　　 結(jié)果:
　　 1 Sham組、CLP組小鼠生物學(xué)行為改變基本同第一部分,CI組小鼠術(shù)后表現(xiàn)程度輕于CLP組。
　　 2 血清Cr:與sham組比較,CLP組6h Cr濃度顯著升高(P＜0.05),12h后開始下降,與sham組沒有顯著性差異(P＞0.05),但仍高于sham組;與CLP組比較,CI組血清Cr濃度6h顯著性降低(P＜0.05),但仍顯著性

15、高于sham組(P＜0.05),于12h、24h持續(xù)降低至sham組水平(P＞0.05)。血清BUN:與sham組比較,CLP組各時(shí)間點(diǎn)BUN濃度均顯著升高(P＜0.05);與CLP組比較,CI組各時(shí)間點(diǎn)的血清BUN濃度均顯著性降低(P＜0.05),與sham組相比沒有顯著性差異。三組血清Cr、BUN濃度組內(nèi)比較各時(shí)間點(diǎn)均沒有顯著性差異(p＞0.05)。
　　 3 光鏡下sham組、CLP組腎組織病理?yè)p傷變化基本同第一部分;CI

16、組腎小球、腎小管損傷輕于CLP。三組均未見腎細(xì)胞壞死現(xiàn)象。與sham組相比,CLP組各時(shí)間點(diǎn)腎組織病理?yè)p傷評(píng)分均顯著性增加(P＜0.05),CI組6h、12h腎組織病理?yè)p傷評(píng)分顯著高于sham組(P＜0.05);與CLP組相比較,CI組各時(shí)間點(diǎn)均有降低,但無(wú)顯著性差異(P＞0.05),并于24h達(dá)到sham組水平(P＞0.05);三組組內(nèi)比較各時(shí)間點(diǎn)均無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。
　　 4 與sham組比較,CLP組各時(shí)間點(diǎn)腎

17、組織細(xì)胞凋亡率顯著性升高(均P＜0.05),分別為(18.27±1.4 vs.6.17±0.9、15.86±3.5 vs5.60±0.6、12.48±2.1 vs.5.64±0.5)(％);與CLP組比較,CI組各時(shí)間點(diǎn)的腎組織細(xì)胞凋亡率顯著性降低(均P＜0.05),分別為(13.88±3.2、10.48±3.6、8.45±1.8)(％),但仍顯著性高于sham組(P＜0.05);sham組組內(nèi)比較沒有顯著性差異(P＞0.05),CLP

18、組、CI組腎組織細(xì)胞凋亡率逐漸降低,并于24h顯著性低于6h(P＜0.05)。
　　 5 與sham組相比,CLP組各時(shí)間點(diǎn)腎組織caspase-3mRNA表達(dá)均顯著性上調(diào)(P＜0.05);與CLP組比較,CI組各時(shí)間點(diǎn)腎組織caspase-3mRNA表達(dá)均顯著性降低(P＜0.05),Ac-DEVD-CHO對(duì)easpase-3mRNA表達(dá)的抑制率在53％左右。Sham組、CI組組內(nèi)比較沒有顯著性差異(P＞0.05),CLP組腎組

19、織caspase-3mRNA表達(dá)呈上升趨勢(shì),并于24h較6h比較有顯著性差異(P＜0.05)。Caspase-3蛋白主要表達(dá)于腎小管上皮細(xì)胞、腎小球血管內(nèi)皮細(xì)胞胞質(zhì)和胞核中。Caspase-3蛋白在CLP組表達(dá)增多,CI組有所降低,但是三組比較均沒有顯著性差異(P＞0.05)。
　　 6 Sham組、CLP組、CI組4天存活率分別為100％、40％、80％,CLP組、CI組與sham組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);CI組

20、與模型組比較差異雖無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但CI組死亡小鼠的存活時(shí)間可延長(zhǎng)24h左右。Sham組、CLP組、CI組7天存活率分別為100％、20％、20％,假手術(shù)組與后兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＜0.05)。
　　 小結(jié):
　　 1 腎組織細(xì)胞凋亡是膿毒癥AKI小鼠主要腎組織病理特點(diǎn),未見細(xì)胞壞死現(xiàn)象。
　　 2 膿毒癥AKI小鼠腎組織caspase-3表達(dá)顯著性增高,Ac-DEVD-CHO顯著降低膿毒癥AKI小鼠腎組

21、織caspase-3表達(dá),從而降低了腎組織細(xì)胞的凋亡率,并且減輕了腎組織病理?yè)p傷,改善了腎功能,說(shuō)明腎組織細(xì)胞凋亡可能是多菌感染膿毒癥AKI的主要病理生理機(jī)制;選擇性caspase-3抑制劑預(yù)防性應(yīng)用對(duì)腹腔多菌感染膿毒癥AKI小鼠腎功能有保護(hù)作用,此為進(jìn)一步研究膿毒癥AKI發(fā)病機(jī)制及進(jìn)行抗凋亡的臨床研究提供了理論依據(jù)。
　　 3 應(yīng)用Ac-DEVD-CHO沒有改善最終預(yù)后,提示在平衡膿毒癥和凋亡中,有眾多因素參與,還需要進(jìn)一步研

22、究探討。 第三部分炎癥反應(yīng)在膿毒癥AKI小鼠中的作用及選擇性caspase-3抑制劑預(yù)防性干預(yù)的研究
　　 目的:探討炎癥反應(yīng)在腹腔多種微生物感染膿毒癥誘發(fā)急性腎損傷(AKI)中的作用,以及炎癥反應(yīng)和腎組織細(xì)胞凋亡之間的關(guān)系及選擇性caspase-3抑制劑對(duì)其的影響。
　　 方法:實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、分組及模型制備方法同第二部分。應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)檢

23、測(cè)血清腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)、白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-6、IL-10水平,其余觀察檢測(cè)同第二部分。統(tǒng)計(jì)方法同第二部分。
　　 結(jié)果:
　　 1 小鼠生物學(xué)行為改變同第二部分。
　　 2 小鼠腎功能改變同第二部分。
　　 3 小鼠腎組織病理?yè)p傷變化同第二部分。
　　 4 小鼠腎組織細(xì)胞凋亡及easpase-3表達(dá)變化同

24、第二部分。
　　 5 與sham組比較,CLP組CLP后各時(shí)間點(diǎn)血清TNF-α、IL-6、IL-10水平顯著性升高。TNF-α(μg/L):6h:653.6±8.9vs.29.5±19.0,12h:579.7±137.1 vs.28.3±9.3,24h:551.0±119.8 vs.26.3±8.9,(P＜0.05);IL-6(μg/L):6h:1595.3±159.4 vs.38.2±8.5,12h:1330.7±249.8

25、vs.32.0±9.0,24h:815.3±572.7 vs.24.3±9.7,(P＜0.05);IL-10(μg/L):6h:26.6±4.5 vs.5.1±1.2,12h:24.5±4.3 vs.4.9±1.0,24h:18.2±1.6 vs.4.9±1.2,(P＜0.05)。與CLP組比較,CI組各時(shí)間點(diǎn)血清TNF-α、IL-6水平顯著性降低[TNF-α(μg/L):436.2±64.2,233.4±85.4,151.0±90.3

26、;IL-6(μg/L):1033.2±345.8,366.3±68.3,241.2±208.4,均P＜0.05)],但仍顯著性高于sham組(P＜0.05),IL-10水平12h、24h顯著性升高(37.2±5.0,38.3±5.5,均P＜0.05)。
　　 6 三組小鼠病死率同第二部分。
　　 小結(jié):
　　 1 膿毒癥AKI時(shí)血清促炎介質(zhì)TNF-α、IL-6濃度及抗炎介質(zhì)IL-10濃度均顯著性增高,其中促炎介質(zhì)

27、TNF-α、IL-6升高倍數(shù)更是明顯高于抗炎介質(zhì)IL-10,6h分別升高22.13倍、41.78倍、5.218倍,伴有腎功能下降、腎組織細(xì)胞凋亡增加、存活率降低。
　　 2 Caspase-3抑制劑通過(guò)降低膿毒癥AKI腎組織細(xì)胞凋亡率,下調(diào)腎臟caspase-3mRNA水平,顯著下調(diào)了血清促炎介質(zhì)INF-α、IL-6水平,上調(diào)了抗炎介質(zhì)IL-10水平,平衡了炎癥反應(yīng)綜合征和代償性抗炎反應(yīng)綜合征,改善了腎功能,降低了病死率。

28、>　　 3 上述結(jié)果表明炎癥反應(yīng)是多菌感染膿毒癥AKI的主要發(fā)病機(jī)制之一,通過(guò)干預(yù)凋亡能夠調(diào)整、平衡炎癥反應(yīng),由此進(jìn)一步證明腎細(xì)胞凋亡在多菌感染膿毒癥AKI中的重要作用。此為進(jìn)一步研究膿毒癥AKI發(fā)病機(jī)制及進(jìn)行抗凋亡的臨床研究提供了理論依據(jù)。
　　 第四部分 TLR4/9在膿毒癥AKI小鼠中的作用及其siRNA預(yù)防性干預(yù)的研究
　　 目的:觀察腹腔多菌感染膿毒癥AKI時(shí)腎組織TLR4/9的表達(dá)及Toll樣受體4/9小干

29、擾RNA對(duì)腹腔多菌感染膿毒癥急性腎損傷小鼠腎細(xì)胞凋亡的影響,探討TLR4/9在多菌感染膿毒癥AKI發(fā)病機(jī)制中的作用。
　　 方法:
　　 1 體外實(shí)驗(yàn):選用小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)。針對(duì)小鼠TLR4和TLR9編碼序列分別設(shè)計(jì)2條體外轉(zhuǎn)錄的小干擾RNA(small interference RNA,siRNA):S-T41、S-T42、S-T91和S-T92。優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件后將siRNA分別轉(zhuǎn)染入RAW

30、264.7細(xì)胞,于轉(zhuǎn)染后48小時(shí)收集細(xì)胞,應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量方法和免疫印跡法檢測(cè)TLR4,9mRNA、蛋白表達(dá),確定沉默效果最佳,且相互之間沒有非特異性沉默的siRNA,將其用作體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。
　　 2 體內(nèi)實(shí)驗(yàn):健康清潔級(jí)雄性C57BL/6小鼠170只,隨機(jī)分為5組,假手術(shù)組(sham組)、空白對(duì)照組(S-B組)、空質(zhì)粒對(duì)照組(S-N組)、TLR4 siRNA干預(yù)組(S-T4組)、TLR9 siRNA干預(yù)組(S-T9組)。采用盲腸結(jié)

31、扎穿孔術(shù)(CLP)制備膿毒癥AKI小鼠模型,各組均于制模前24h應(yīng)用尾靜脈水動(dòng)力注射法注射TransIT-EE Hydrodynamic DeliverySolution(水動(dòng)力注射液,美國(guó)Mirus Bio公司)1.5ml,空質(zhì)粒對(duì)照組、siRNA干預(yù)組分別隨之導(dǎo)入空質(zhì)粒、TLR4/9 siRNA質(zhì)粒50μg,5s注射完。CLP方法同第一部分。根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求,五組均在制模后設(shè)置6h、12h、24h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)組,每組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)組8只小鼠,

32、檢測(cè)血肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)濃度,用流式細(xì)胞術(shù)和TUNEL法檢測(cè)腎組織細(xì)胞凋亡,實(shí)時(shí)熒光定量。PCR法檢測(cè)腎組織caspase-3mRNA、TLR4表達(dá),免疫組化法檢測(cè)caspase-3、TLR4在腎臟的表達(dá),每組余10只小鼠觀察生物學(xué)行為變化及4天、7天病死率。統(tǒng)計(jì)方法同第二部分。
　　 結(jié)果:
　　 1 體內(nèi)實(shí)驗(yàn):S-T41、S-T91分別較S-T42、S-T92能夠有效沉默RAW264.7細(xì)胞TLR4和TL

33、R9的表達(dá),且特異性好。我們選用S-T41、S-T91作為體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的siRNA。體外實(shí)驗(yàn):在S-B和S-N組之間,所有結(jié)果均沒有顯著性差異(均P＞0.05);在S-T4和S-T9組之間,除血清BUN濃度、TLR4表達(dá)外,所有結(jié)果均沒有顯著性差異(均P＞0.05)。
　　 2 小鼠生物學(xué)行為改變:Sham組與S-B、S-N組小鼠生物學(xué)行為改變基本同第二部分的sham組與CLP組;S-T4和S-T9組小鼠生物學(xué)行為改變程度輕于S-B

34、和S-N組。
　　 3 (1)血清Cr濃度:與sham組比較,S-B、S-N組6h血清Cr濃度均顯著性升高(P＜0.05),12h、24h仍高于sham組,但無(wú)顯著性差異(P＞0.05);與S-B、S-N組比較,S-T4、S-T9組6h血清Cr濃度均顯著性降低(P＜0.05),在12h、24h時(shí)點(diǎn)沒有顯著性差異(P＞0.05),但仍低于S-B、S-N組,并至sham組水平(P＞0.05)。各組組內(nèi)比較各時(shí)間點(diǎn)均無(wú)顯著性差異。(2

35、)血清BUN濃度:與sham組比較,S-B、S-N組各時(shí)間點(diǎn)血清BUN濃度均顯著性升高(P＜0.05),S-T4、S-T9組僅在6h濃度顯著性升高(P＜0.05);與S-B、S-N組比較,S-T4、S-T9組各時(shí)間點(diǎn)濃度均顯著性降低(P＜0.05),至24h,S-T9組濃度更是顯著性低于S-T4組(P＜0.05)。Sham、S-B、S-N、S-T4組組內(nèi)比較沒有顯著性差異(P＞0.05),S-T9組濃度進(jìn)行性降低,各時(shí)間點(diǎn)之間均有顯著性

36、差異(P＜0.05)。
　　 4 腎組織病理?yè)p傷變化:各組腎組織病理?yè)p傷以細(xì)胞凋亡為主,未見細(xì)胞壞死現(xiàn)象。與sham組比較,S-B、S-N組各時(shí)間點(diǎn)腎組織病理?yè)p傷評(píng)分均顯著增高(P＜0.05),6h時(shí),S-T4組顯著高于sham組,隨后S-T4、S-T9組雖然高于sham組,但是沒有顯著性差異(P＞0.05)。與S-B、S-N組比較,S-T9組各時(shí)間點(diǎn)均顯著性降低(P＜0.05),S-T4組于12h、24h顯著性降低(P＜0.0

37、5)。各組組內(nèi)均呈下降趨勢(shì),尤其在S-T4、S-T9組,24h顯著性低于6h(P＜0.05)。
　　 5 凋亡相關(guān)變化:(1)與sham組比較,S-B、S-N組各時(shí)間點(diǎn)腎組織細(xì)胞凋亡率均顯著性降低(P＜0.05),與S-B、S-N組相比較,S-T4、S-T9組均顯著性降低(P＜0.05)。S-B、S-N組腎細(xì)胞凋亡率進(jìn)行性降低,24h顯著性低于6h、12h(P＜0.05),余組組內(nèi)比較沒有顯著性差異(P＞0.05)。(2)TUN

38、EL檢測(cè)結(jié)果表明sham、S-T4、S-T9組凋亡細(xì)胞較少,S-B、S-N組細(xì)胞凋亡數(shù)明顯增多,凋亡細(xì)胞主要見于腎皮質(zhì)腎小管上皮細(xì)胞,腎小球少見。
　　 6 Caspase-3表達(dá)變化:(1)Caspase-3mRNA:與sham組相比較,SB、SN、S-T4、S-T9組caspase-3mRNA表達(dá)均顯著性增高(P＜0.05),分別升高5.21、5.03、2.83、2.69倍。與S-B、S-N組相比較,S-T4、S-T9組ca

39、spase-3mRNA表達(dá)均顯著性降低(P＜0.05),較S-N組分別下降44％和47％。(2)免疫組化檢查顯示:Caspase-3蛋白主要表達(dá)于腎小管上皮細(xì)胞、腎小球血管內(nèi)皮細(xì)胞胞質(zhì)和胞核中。與sham組相比較,S-B、S-N組caspase-3蛋白表達(dá)均顯著性增加(P＜0.05),與S-B、S-N組相比較,S-T4、S-T9組caspase-3蛋白表達(dá)均顯著性降低(P＜0.05),與sham組相比較沒有顯著性差異(P＞0.05)。<

40、br>　　 7 TLR4表達(dá)變化:(1)與sham組相比較,S-B、S-N、S-T9組TLR4mRNA表達(dá)均顯著性增高(P＜0.05),分別升高4.28、4.35、2倍。與S-B、S-N組相比較,S-T4、S-T9組TLR4mRNA表達(dá)均顯著性降低(P＜0.05),較SN組分別降低89％和54％,S-T4組同時(shí)顯著性低于sham組和S-T9組(P＜0.05)。(2)免疫組化檢查顯示:蛋白主要表達(dá)于腎小管上皮細(xì)胞、腎小球血管內(nèi)皮細(xì)胞胞質(zhì)

41、和胞核中。與sham組相比較,S-B、S-N組TLR4蛋白表達(dá)均顯著性增加(P＜0.05),與S-B、S-N組相比較,S-T4、S.T9組TLR4蛋白表達(dá)均顯著性降低(P＜0.05),與sham組相比較沒有顯著性差異(P＞0.05),雖然S-T4、S-T9組之間比較沒有顯著性差異,但結(jié)果顯示S-T9組TLR4蛋白表達(dá)高于S-T4組。
　　 8 存活率改變:S-B組與S-N組、S-T4組與S-T9組之間比較沒有顯著性差異(P＞0.

42、05)。Sham組、S-B組、S-N組、S-T4組、S-T9組4天存活率分別為100％、40％、50％、80％、80％,7天存活率分別為100％、20％、30％、70％,80％。與sham組相比較,S-B組、S-N組4天、7天生存率較均顯著性降低(P＜0.05)。與S-B組、S-N組相比較,S-T4組、S-T9組4天存活率比較雖沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05),但是存活率有明顯改善;7天存活率,S-T9組存活率顯著性增高,而S-T4組較S

43、-N組有顯著性差異(P=0.021,P＜0.05),但與S-B組沒有顯著性差異(P=0.075,P＞0.05)。
　　 小結(jié):
　　 1 在體外實(shí)驗(yàn),本部分實(shí)驗(yàn)中所設(shè)計(jì)、合成的TLR4/9 siRNA能夠有效沉默小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7上TLR4/9的表達(dá),且不存在非特異性沉默現(xiàn)象,證明我們所應(yīng)用的小干擾RNA是有效的、特異的;
　　 2 制模前24h尾靜脈水動(dòng)力注射法體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)TLR4 siRNA質(zhì)粒,能有效

44、沉默腎組織TLR4的表達(dá),證明此方法是一種有效的活體組織內(nèi)轉(zhuǎn)染siRNA的方法;轉(zhuǎn)導(dǎo)TLR9 siRNA質(zhì)粒后,同樣有效沉默腎組織TLR4的表達(dá),可能與減少TLR4的內(nèi)源性配體有關(guān);
　　 3 尾靜脈水動(dòng)力注射法體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)TLR4 siRNA,能夠顯著降低腎組織細(xì)胞凋亡,減輕腎組織病理?yè)p傷,改善腎功能及預(yù)后,可能與下調(diào)免疫細(xì)胞和/或腎實(shí)質(zhì)細(xì)胞TLR4的表達(dá)有關(guān);
　　 4 尾靜脈水動(dòng)力注射法體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)TLR9 siRNA,能

45、夠顯著降低腎組織細(xì)胞凋亡,減輕腎組織病理?yè)p傷,改善腎功能及預(yù)后,可能與下調(diào)免疫細(xì)胞TLR9的表達(dá)有關(guān);
　　 5 TLR4/9 siRNA能夠改善腹腔感染膿毒癥AKI小鼠腎功能及預(yù)后,證明TLR4,9在其中起著關(guān)鍵作用。
　　 第五部分 TLR4/9 siRNA預(yù)防性干預(yù)對(duì)膿毒癥AKI小鼠炎癥反應(yīng)的影響
　　 目的:探討Toll樣受體4/9小干擾RNA對(duì)腹腔多菌感染膿毒癥急性腎損傷小鼠炎癥反應(yīng)的影響和對(duì)膿毒癥AK

46、I的保護(hù)作用。
　　 方法:實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、分組與制模同第四部分。應(yīng)用雙抗夾心酶聯(lián)免疫吸附法(EIASA)檢測(cè)血清炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-6、IL-10方法,具體方法同第三部分。其他主要方法均同第四部分。
　　 結(jié)果:S-B,S-N組之間比較各時(shí)間點(diǎn)主要結(jié)果均無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。1各組小鼠生物學(xué)行為及腎功能變化、腎組織病理?yè)p傷變化及腎組織TLR4mRNA、免疫組化變化均見第四部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果。2血清TFNF-α水平

47、變化:與sham組相比較,S-B、S-N、S-T4和S-T9組各時(shí)間點(diǎn)血清TNF-α水平均顯著性升高(P＜0.05)。與S-B、S-N組相比較,S-T4和S-T9組組各時(shí)間點(diǎn)血清TNF-α水平均顯著性降低(P＜0.05),S-T9組更是降低了S-T4組的水平(P＜0.05)。Sham、S-B、S-N組組內(nèi)比較均沒有顯著性差異(P＞0.05)。S-T4和S-T9血清TNF-α水平逐漸降低,并于24h顯著性低于6h和12h(P＜0.05)。

48、3血清IL-6水平變化:與sham組相比較,S-B,S-N,S-T4和S-T9組各時(shí)間點(diǎn)血清IL-6水平顯著性升高(P＜0.05)。與S-B,S-N組相比較,S-T4組各時(shí)間點(diǎn)血清IL-6水平均顯著性降低(P＜0.05);S-T9組血清IL-6水平于12h、24h均顯著性低于S-B、S-N、S-T4組(P＜0.05)。各組組內(nèi)血清IL-6水平均呈下降趨勢(shì),S-B、S-N組24h與6h、12h相比較均有顯著性降低(P＜0.05),S-T4

49、、S-T9組內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)均有顯著性差異(P＜0.05)。4血清IL-10水平變化:S-T4和S-T9組間各時(shí)間點(diǎn)比較均沒有顯著性差異(P＞0.05)。與sham組相比較,S-B、S.N、S-T4和S-T9組各時(shí)間點(diǎn)血清IL-10水平顯著性升高(P＜0.05),但是S-T4和S-T9組血清IL-10水平升高不如S-B和S-N組(P＜0.05)。與S-B、S-N組相比較,S-T4、S-T9組12h、24h時(shí)間點(diǎn)血清IL-10水平均進(jìn)一步顯著性

50、升高(P＜0.05)。S-B、S-N組組內(nèi)血清IL-10水平進(jìn)行性下降,24h與6h、12h相比較均有顯著性降低(P＜0.05),S-T4、S-T9組進(jìn)行性上升,12h、24h均與6h有顯著性差異(P＜0.05)。
　　 小結(jié):
　　 1 制模前24h分別尾靜脈水動(dòng)力注射法轉(zhuǎn)導(dǎo)TLR4/9 siRNA質(zhì)粒,均顯著降低了膿毒癥AKI血清中促炎介質(zhì)TNF-α、IL-6濃度,進(jìn)一步升高了血清中抗炎介質(zhì)IL-10濃度,平衡了炎癥

51、反應(yīng);
　　 2 TLR4 siRNA對(duì)于多菌感染膿毒癥AKI的腎保護(hù)作用可能是通過(guò)TLR4 siRNA下調(diào)了免疫細(xì)胞和/或腎實(shí)質(zhì)細(xì)胞TLR4的表達(dá)而調(diào)整了促炎和抗炎之間的平衡達(dá)到的:
　　 3 TLR9 siRNA對(duì)于多菌感染膿毒癥AKI的腎保護(hù)作用可能是通過(guò)TLR9 siRNA下調(diào)了免疫細(xì)胞TLR9的表達(dá)而調(diào)整了促炎和抗炎之間的平衡達(dá)到的;
　　 4 TLR4/9 siRNA對(duì)于腹腔感染膿毒癥AKI具有腎保護(hù)

52、作用,證明TLR4,9在其中起著關(guān)鍵作用。
　　 綜合上述五部分內(nèi)容,本研究得出如下結(jié)論:
　　 1 盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)(CLP)能夠成功制備腹腔多菌感染膿毒癥AKI模型。
　　 2 在CLP所誘導(dǎo)的AKI中,腎組織細(xì)胞凋亡是其主要病理生理特點(diǎn);
　　 應(yīng)用選擇性caspase-3抑制劑Ac-DEVD-CHO,能夠降低腎組織細(xì)胞凋亡,改善腎功能及預(yù)后,進(jìn)一步證明腎組織細(xì)胞凋亡在多菌感染膿毒癥AKI發(fā)病機(jī)制中的

53、重要作用;此為進(jìn)一步研究膿毒癥AKI發(fā)病機(jī)制及進(jìn)行抗凋亡的臨床研究提供了理論依據(jù)。
　　 3 在CLP所誘導(dǎo)的AKI中,炎癥反應(yīng)是其主要發(fā)病機(jī)制之一,應(yīng)用選擇性caspase-3抑制劑Ac-DEVD-CHO,即通過(guò)抗凋亡手段能夠平衡炎癥反應(yīng),此再次為進(jìn)一步研究膿毒癥AKI發(fā)病機(jī)制及進(jìn)行抗凋亡的臨床研究提供了理論依據(jù)。
　　 4 膿毒癥AKI時(shí)小鼠腎組織TLR4表達(dá)上調(diào)。尾靜脈水動(dòng)力注射法體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)TLR4 siRNA,能夠

54、顯著降低腎組織細(xì)胞凋亡、平衡炎癥反應(yīng),減輕腎組織病理?yè)p傷,改善腎功能及預(yù)后,可能與下調(diào)免疫細(xì)胞和/或腎實(shí)質(zhì)細(xì)胞TLR4的表達(dá)有關(guān);尾靜脈水動(dòng)力注射法體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)TLR9siRNA,能夠顯著降低腎組織細(xì)胞凋亡、平衡炎癥反應(yīng),減輕腎組織病理?yè)p傷,改善腎功能及預(yù)后,可能與下調(diào)免疫細(xì)胞TLR9的表達(dá)有關(guān),證明TLR4,9在多菌感染膿毒癥AKI的發(fā)病機(jī)制中起著關(guān)鍵作用。siRNA技術(shù)、尾靜脈水動(dòng)力注射法能夠成功沉默小鼠腎組織相關(guān)基因表達(dá),為今后的TL