辣椒輕斑駁病毒的鑒定及基因組分析.pdf

1、辣椒輕斑駁病毒(Pepper mild mottle virus，PMMOV)屬煙草花葉病毒屬(Tobamovirus)，主要寄生于甜椒、線椒，造成辣椒減產(chǎn)，質(zhì)量降低。基于病毒的巨大危害，本研究通過生物學(xué)方法、RT-PCR技術(shù)和ELISA方法對辣椒輕斑駁病毒進(jìn)行檢測，并獲得了一個(gè)辣椒輕斑駁病毒中國分離物的基因組全序列;此外，還分析了鮑氏層孔菌多糖的三種純化組分對病毒增殖的影響。
　　1、利用摩擦接種法，將辣椒輕斑駁病毒接種于煙草葉

2、片，接種煙草葉片出現(xiàn)花葉、褪綠、褶皺、卷曲、壞死斑癥狀。利用RT-PCR技術(shù)，分別利用兩對引物對辣椒輕斑駁病毒進(jìn)行了擴(kuò)增，獲得了預(yù)期片段，并經(jīng)測序證明其為病毒特異片段。利用AGDIA的DAS-ELISA檢測試劑盒對辣椒輕斑駁病毒進(jìn)行了檢測，該試劑盒可有效檢測辣椒輕斑駁病毒。
　　2、建立了基于干燥葉片提取總RNA的技術(shù)體系。該體系首先在65℃下干燥辣椒或者煙草葉片，再采用CTAB法提取核酸，可有效提取出辣椒或煙草總RNA。獲得的R

3、NA條帶清晰，無拖尾。以此總RNA為模板，可有效且穩(wěn)定地?cái)U(kuò)增出大于2000 bp病毒部分基因組片段。
　　3、利用RT-PCR技術(shù)，獲得了一個(gè)辣椒輕斑駁病毒中國分離物的基因組全序列。該序列全長6294 bp，比GenBank中辣椒輕斑駁病毒分離物全基因組少63個(gè)核苷酸。包含四個(gè)開放閱讀框，推測分別編碼183 KDa、126 KDa、28 KDa、17 KDa蛋白質(zhì)。本研究中獲得的分離物與日本分離物親緣關(guān)系較近，與已報(bào)道的可破壞辣椒

4、L3抗性基因的分離物親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，推測本研究中獲得的分離物不能破壞辣椒L3抗性基因。
　　4、經(jīng)過離子交換層析純化，將鮑氏層孔菌粗多糖分為三個(gè)部分，分別命名為PIP30-Ⅰ、PIP60-Ⅰ、PIP80-Ⅰ。將辣椒輕斑駁病毒分別接種煙草植株，利用DAS-ELISA分析鮑氏層孔菌多糖處理對辣椒輕斑駁病毒接種及增殖的影響。結(jié)果顯示，多糖組分PIP80-Ⅰ、PIP30-Ⅰ有鈍化該病毒的作用，無抑制或者治療作用。PIP60-Ⅰ多糖對辣椒輕斑