AnnexinⅡ蛋白的原核表達和AnnexinⅡ基因在急性白血病患者中的表達差異研究.pdf

1、Annexin II是鈣介導(dǎo)的磷脂結(jié)合蛋白超家族成員之一，表達于內(nèi)皮細胞、單核巨噬細胞、神經(jīng)細胞和一些腫瘤細胞。Annexin II是纖維蛋白溶解酶原(PLG)和組織型纖溶酶原激活物(t-PA)的共同受體，在血管內(nèi)皮上能顯著增加t-PA介導(dǎo)的纖溶酶形成效率。目前研究發(fā)現(xiàn)，Annexin II異常高表達是M3型急性髓系白血病(APL)出血合并癥的重要機制之一。此外，研究發(fā)現(xiàn)Annexin II還與某些實體腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移、血管新生密切相關(guān)

2、。鑒于Annexin II的重要病理生理功能，本研究旨在基礎(chǔ)和臨床兩方面對Annexin II的功能作進一步探討。我們用大腸桿菌為宿主表達了Annexin II融合蛋白，并以該重組蛋白為抗原免疫小鼠，用細胞融合和單克隆篩選技術(shù)制備了抗Annexin II單克隆抗體，利用所制備的單克隆抗體初步建立了流式方法檢測細胞表面Annexin II蛋白的表達水平；此外還運用熒光定量PCR(Real-time PCR)方法對急性白血病細胞株以及急性白

3、血病病人骨髓單個核細胞Annexin II mRNA的表達水平進行了測定和比較，以進一步探索Annexin II的功能及可能的作用機制。 1.Annexin II蛋白的原核表達 我們利用含有Annexin II全長cDNA的質(zhì)粒pET-T1/C2-Annexin II轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3) pLysS，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達目的蛋白。原核表達的重組Annexin II相對分子量約39kDa，經(jīng)Ni-NTA agaro

4、se柱純化獲得了部分純化的蛋白后免疫Balb/c小鼠。小鼠脾細胞與雜交瘤細胞融合后篩選獲得二株持續(xù)分泌單克隆抗體的細胞株，命名為S2-135和S2-136。兩株雜交瘤細胞單克隆后接種小鼠腹腔產(chǎn)生腹水，間接ELISA法測定其效價分別為5×10-5和6×10-5。瓊脂糖雙擴散法顯示兩株抗體皆為IgG1亞類。腹水經(jīng)蛋白G-Sephrose4B親和層析柱純化后濃度分別為0.25mg/ml和0.5mg/ml。Western blot分析顯示兩株單

5、抗均能夠識別相對分子量為39kDa的重組蛋白且能夠特異性地識別還原條件下NB4和U937細胞裂解液中分子量約36kDa的蛋白。本研究制備出抗AnnexinⅡ的特異性單克隆抗體，經(jīng)過鑒定表明該抗體具有較高的特異性和親和力，對于進一步探討AnnexinⅡ的功能具有重要意義。 2.AnnexinⅡ在急性白血病患者中的表達差異及臨床意義 本研究探討急性白血病患者骨髓細胞AnnexinⅡ基因的表達水平。建立熒光定量PCR(Rea1

6、-time PCR)方法，檢測急性白血病細胞患者骨髓單個核細胞AnnexinⅡmRNA的表達水平。實驗結(jié)果顯示：AnnexinⅡ在NB4中的表達明顯高于其它細胞株，在U937以及SHI-1中也有較高表達。AnnexinⅡ在初治M3型急性白血病患者骨髓中的表達顯著高于其它類型急性白血病和正常對照者，此外在初治M5、M4患者骨髓中也有較高表達，而在初治M1以及M2患者中表達量與正常對照比無統(tǒng)計學(xué)差異。結(jié)論：AnnexinⅡ除在M3中高表達外