乳腺上皮細胞條件培養(yǎng)基對人脂肪干細胞增殖和上皮分化的影響.pdf

1、第一部分人乳腺上皮細胞的分離培養(yǎng)和條件培養(yǎng)基的制備
　　目的：分離和培養(yǎng)人肥大乳房乳腺上皮細胞,制備分別來自人肥大乳房乳腺上皮細胞和正常乳腺上皮細胞的條件培養(yǎng)基。
　　方法：采用膠原酶消化法從人肥大乳房的乳腺組織中分離乳腺上皮細胞,并傳代培養(yǎng)至第3代;復(fù)蘇凍存的人正常乳腺上皮細胞株(HBL-100),并進行培養(yǎng)。MTT法繪制兩種細胞的生長曲線,比較其增殖能力的差別。收集兩種乳腺上皮細胞的上清液,制備條件培養(yǎng)基。對條件培養(yǎng)基進

2、行質(zhì)量檢測。
　　結(jié)果：分離和培養(yǎng)的人肥大乳房乳腺上皮細胞,以及復(fù)蘇的正常乳腺上皮細胞株(HBL-100)生長狀況良好,為典型的上皮細胞形態(tài)。MTT法顯示兩種細胞的光密度值(OD值)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。制備的條件培養(yǎng)基外觀清亮、無菌、PH值7.35±0.06、葡萄糖濃度為100㎎/dl。
　　結(jié)論：同樣培養(yǎng)條件下,HBL-100較肥大乳房乳腺上皮細胞的增殖能力強。成功制備來自于乳腺上皮細胞的符合細胞培養(yǎng)基本要求

3、的條件培養(yǎng)基。
　　第二部分不同條件培養(yǎng)基對人脂肪干細胞增殖能力的影響
　　目的：觀察兩種條件培養(yǎng)基對人脂肪干細胞生長和增殖能力的影響,為下一步誘導(dǎo)脂肪干細胞定向分化篩選合適的條件培養(yǎng)基。
　　方法：體外分離和培養(yǎng)人脂肪干細胞,采用流式細胞儀檢測細胞表面標記物CD13、CD29、CD44、CD45、CD90和CD105的表達,并體外誘導(dǎo)脂肪干細胞向脂肪細胞和軟骨細胞分化。用不同條件培養(yǎng)基培養(yǎng)脂肪干細胞,MTT法繪制細胞

4、的生長曲線,比較不同條件培養(yǎng)基對脂肪干細胞增殖能力的差別。
　　結(jié)果：體外分離和培養(yǎng)的人脂肪干細胞生長狀況良好,呈典型的成纖維細胞形態(tài)。流式細胞儀檢測結(jié)果顯示CD13、CD29、CD44、CD90和CD105陽性表達,而不表達CD45,經(jīng)成脂和成軟骨定向誘導(dǎo),細胞分別出現(xiàn)脂肪細胞和軟骨細胞的表型特征。脂肪干細胞經(jīng)人肥大乳房乳腺上皮細胞和HBL-100的條件培養(yǎng)基培養(yǎng)后,分別出現(xiàn)細胞數(shù)目減少和增殖旺盛的現(xiàn)象。
　　結(jié)論：來自于

5、人肥大乳房乳腺上皮的條件培養(yǎng)基不能促進脂肪干細胞的正常生長和增殖。而來自于人正常乳腺上皮細胞株(HBL-100)的條件培養(yǎng)基可促進細胞的正常增殖,適合于用作脂肪干細胞的培養(yǎng)液。
　　第三部分條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)人脂肪干細胞向乳腺上皮細胞分化的實驗研究
　　目的：探討條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)人脂肪干細胞(ADSCs)向乳腺上皮細胞定向分化的可行性。
　　方法：實驗組和對照組分別采用條件培養(yǎng)基和DMEM/F12﹢10％FBS培養(yǎng)脂肪干細胞

6、,培養(yǎng)16天,Westernblot檢測細胞表面標志物卵透明帶蛋白1(zonaoccludensprotein1,ZO1)和細胞角蛋白18(cytokeratin18,CK18)的表達。誘導(dǎo)分化后的細胞在體外進行三維培養(yǎng)16天,免疫熒光細胞染色法檢測細胞IV型膠原的表達,QRT-PCR檢測細胞α-酪蛋白(α-casein)mRNA表達。
　　結(jié)果：培養(yǎng)后14天,實驗組誘導(dǎo)后的細胞形態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)樯掀拥膱A形,Westernblot檢測上