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文檔簡介
1、目的:血腦屏障(blood-brain barrier,BBB)完整性的破壞已成為實驗性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)和人類多發(fā)性硬化(multiplesclerosis,MS)發(fā)病機制中的重要環(huán)節(jié)。本實驗應(yīng)用雌二醇(estradiol,E2)治療Wistar大鼠去卵巢后EAE,觀察臨床療效和潛在的免疫學(xué)機制,目的在于探討EAE的發(fā)病機制和應(yīng)用E2治療EA
2、E的作用機制,為今后臨床應(yīng)用雌激素輔助治療MS等CNS自身免疫性疾病提供實驗依據(jù)。
方法:制備去卵巢EAE動物模型,隨機分為EAE組、E2治療組和佐劑組。E2治療組從免疫后(post-inoculation,p.i.)0~8天每日肌注E2(250μg/kg)一次。按照國際通用的五分法評估臨床癥狀,觀察體重變化、發(fā)病率等臨床指標(biāo)。觀察各組在不同時間點的血清E2濃度及血清和腦脊液中白蛋白含量比值(CSF to serum al
3、bumin quotient,QA),通過QA評定BBB的損害。在p.i.8、11、14、17天處死動物,采用Western blot和免疫熒光法檢測各組基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)的表達;利用免疫組化技術(shù)檢測CNS中不同部位轉(zhuǎn)化生長因子-β(Transforming growth factor-β,TGF-β)的表達。采用SPSS13.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行分析處理。
4、 結(jié)果:
1.大鼠去卵巢后血清E2水平迅速下降,經(jīng)E2(250μg/kg.d)連續(xù)補充9天后其水平迅速升高,當(dāng)停止補充E2后其又以較快的速度代謝至去卵巢后低水平狀態(tài)。在p.i.8、11、14天,E2治療組血清E2水平較EAE組顯著升高(F=1532.63,P<0.05)。在p.i.17天,E2治療組血清E2代謝至去卵巢后低水平狀態(tài)。
2.EAE組在p.i.11天開始出現(xiàn)明顯的臨床癥狀,起病突然,發(fā)病輕重不一
5、,表現(xiàn)有尾麻痹、后肢無力、體重下降等。在p.i.14天左右發(fā)展為發(fā)病高峰期,進一步表現(xiàn)為后肢癱瘓、易激惹、體重迅速下降,個別處于瀕死狀態(tài)。在p.i.17天左右病情開始緩解,臨床癥狀減輕,體重開始回升,相應(yīng)的臨床癥狀評分下降。E2治療組的發(fā)病率、平均體重減輕、平均癥狀評分、平均病灶數(shù)、平均發(fā)病日期,這5項臨床指標(biāo)與EAE組比較均明顯減少或延遲,均有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。
3.EAE組在p.i.8天時QA值已明顯升高(0
6、.36±0.04),BBB受損較重,之后隨著免疫時間的延長,QA值逐漸下降,BBB的功能逐漸恢復(fù)。E2治療組免疫后初期QA值僅有小幅度的增加,在p.i.14天時達到最大值(0.18±0.03),但增幅較小,出現(xiàn)峰值的時間較EAE組延遲,BBB受損較輕。經(jīng)兩因素多水平方差分析統(tǒng)計表明:在p.i.8~17天,EAE組與E2治療組比較,QA值總的變化趨勢有統(tǒng)計學(xué)差異(F=21.26,P<0.05)。
4.EAE、E2治療和佐劑組
7、的腦和脊髓中均有MMP-9表達。Western blot顯示一條譜帶位于92KD處,代表MMP-9酶原形式,另一條位于83KD處,代表MMP-9活性形式。Western blot及熒光免疫組化檢測表明:EAE組MMP-9表達較佐劑組高(P<0.05),E2治療組與EAE組相比顯著減低(P<0.05)。EAE組MMP-9的表達與癥狀評分呈顯著正相關(guān)(r=0.87,P<0.05)。
5.TGF-β主要由進入CNS的淋巴細胞產(chǎn)生
8、,免疫組化染色陽性表達表現(xiàn)為由血管滲出的淋巴細胞周圍有不同程度著色。結(jié)果顯示:EAE組、E2治療組TGF-β的表達程度與病情輕重相反。經(jīng)圖像分析顯示,E2治療組TGF-β平均積分光密度在炎癥活動高峰期p.i.14天時達到最大值3259.16±541.62,與EAE組(1086.59±214.49)比較有統(tǒng)計學(xué)差異(F=17.36,P<0.05),表明E2治療組TGF-β表達高于EAE組。經(jīng)兩因素多水平方差分析統(tǒng)計表明:在p.i.8~17
9、天,EAE組與E2治療組TGF-β平均積分光密度值比較有統(tǒng)計學(xué)差異(F=23.35,P<0.05),表明E2治療組TGF-β表達明顯高于EAE組。
結(jié)論:
1.去卵巢后EAE血清E2水平降低,經(jīng)補充E2后明顯升高,當(dāng)停止補充E2后又以較快的速度代謝至去卵巢后低水平狀態(tài)。
2.繼早期BBB損傷高峰之后,EAE臨床癥狀開始出現(xiàn)并逐漸加重。
3.EAE發(fā)病高峰期脊髓MMP-9表達明顯上調(diào)
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