間接夾心ELISA檢測(cè)雞毒霉形體研究.pdf

1、雞毒霉形體（Mycoplasma gallisepticum，MG）是雞慢性呼吸道病（Chronic respiratory disease，CRD）和火雞傳染性竇炎（Infectious sinusitis）的主要病原菌。該病的實(shí)驗(yàn)室診斷方法主要有病原的分離鑒定、免疫學(xué)方法、分子生物學(xué)方法等，病原的分離鑒定是診斷MG感染最可靠的方法，但病原分離存在操作復(fù)雜、工作量大、時(shí)間長(zhǎng)等缺點(diǎn)。免疫學(xué)方法有血清平板凝集試驗(yàn)（SPA）、血凝抑制試驗(yàn)（

2、HI）、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）、熒光抗體技術(shù)等。這些方法雖然簡(jiǎn)便易行，但大多只是對(duì)抗體做出檢測(cè)，不能用于MG早期感染和隱性感染的檢測(cè)，且存在非特異性反應(yīng)和交叉反應(yīng)性，所以并不能對(duì)MG感染做出快速準(zhǔn)確的診斷。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）、核酸探針等分子生物學(xué)方法可檢測(cè)抗原，但這些方法對(duì)試驗(yàn)設(shè)備和人員素質(zhì)有很高的要求，目前還難以廣泛推廣和應(yīng)用。
　　 本研究制備了鼠抗MG單克隆抗體和兔抗MG多克隆抗體，建立了針對(duì)MG抗原的間接夾

3、心ELISA檢測(cè)技術(shù)，為雞毒霉形體病的快速診斷提供了一種新的檢測(cè)方法，取得了如下結(jié)果。
　　 1．兔抗MG多克隆抗體的制備
　　 將經(jīng)純化的MG-HS菌液接種于FM-4固體平板上，37℃培養(yǎng)7～10d，取出后在40×顯微鏡下觀察其菌落形態(tài)，呈典型的荷包蛋狀菌落，將MG-HS菌液擴(kuò)大培養(yǎng)并離心，洗滌沉淀4次，制成100倍濃縮菌懸液，測(cè)定蛋白濃度為18mg/ml，所得懸液與弗氏佐劑乳化后免疫家兔，得到兔抗MG的高免血清，其瓊

4、擴(kuò)效價(jià)達(dá)到1：32，經(jīng)飽和硫酸銨粗提、G-200過(guò)柱純化后，經(jīng)SDS-PAGE電泳鑒定其純度，呈典型的IgG條帶，為MG抗原檢測(cè)間接夾心ELISA診斷方法的建立奠定了基礎(chǔ)。
　　 2．MG單克隆抗體的制備與純化
　　 將制成的100倍濃縮菌懸液調(diào)節(jié)濃度至2mg/ml，與弗氏佐劑乳化后免疫BALB/c小鼠，待小鼠血清的ELISA抗體效價(jià)達(dá)1：10000以上時(shí)，將小鼠脫頸椎處死制備免疫脾細(xì)胞，與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合，

5、經(jīng)過(guò)2輪細(xì)胞融合、多次篩選和克隆，最后獲得2株針對(duì)MG的且能穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞（287和6G9）。染色體數(shù)目分別為86.6和86.9；經(jīng)小鼠腹腔接種后收獲腹水，287細(xì)胞株的間接ELISA效價(jià)為1：5.12×105，6G9株的間接ELISA效價(jià)為1：2.56×105，且均不與其它禽類呼吸道病原發(fā)生交叉反應(yīng)；用間接ELISA方法對(duì)2株單抗的相對(duì)親和力進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明287的親和力高于6G9。說(shuō)明這2株單抗特異性強(qiáng)，靈敏度高，

6、可用于MG抗原的ELISA檢測(cè)。
　　 3．檢測(cè)MG抗原的間接夾心EIASA方法的建立
　　 以純化的兔抗MG IgG為第一抗體包被酶標(biāo)板，鼠抗MG單克隆抗體為第二抗體，結(jié)合羊抗鼠IgG-HRP，通過(guò)對(duì)ELISA反應(yīng)條件的優(yōu)化選擇，建立了檢測(cè)MG抗原的間接夾心ELISA法。方陣滴定的結(jié)果表明，兔抗MG IgG的最佳工作濃度為1μg/mL，鼠抗MG單克隆抗體的最佳工作濃度為5μg/mL；用所建立的間接夾心ELISA方法對(duì)3

7、0份健康雞氣管拭子材料進(jìn)行了檢測(cè)，將陰性樣品取平均OD450值，再加上3倍標(biāo)準(zhǔn)差即OD450+3S（0.054+3×0.023=0.123）定為陰、陽(yáng)結(jié)果判定臨界值。但考慮到臨界值與陰性值太接近，故最終將陰、陽(yáng)性結(jié)果的臨界值定為0.2；對(duì)已知的不同濃度梯度的MG培養(yǎng)液進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明該方法所能夠檢測(cè)的MG抗原的濃度下限為5×101cfu/ml，即待檢樣本中含有50個(gè)菌體既能被檢測(cè)為陽(yáng)性；板內(nèi)變異系數(shù)為0.41％～6.72％；板間變異系