漢族人群類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎與細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子3的研究.pdf

1、背景：
　　 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是慢性，進(jìn)行性，主要侵蝕外周滑膜關(guān)節(jié)，以對(duì)稱性多關(guān)節(jié)炎為主要臨床表現(xiàn)的異質(zhì)性、系統(tǒng)性、自身免疫性疾病。我國類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的患病率約為0.32％～0.36％，是造成人群?jiǎn)适趧?dòng)力與致殘的主要病因之一。流行病學(xué)調(diào)查顯示，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)病與性別，年齡，遺傳因素，免疫紊亂，環(huán)境因素密切相關(guān)。類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎多發(fā)于女性，與男性的比例為3:1。類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎80％發(fā)病于3

2、5-50歲。家系調(diào)查發(fā)現(xiàn)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎先證者的一級(jí)親屬發(fā)生類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的概率為11％。對(duì)孿生子的調(diào)查結(jié)果顯示，單卵孿生子同時(shí)患類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的概率為12％～30％，而雙卵孿生子同時(shí)患類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的概率只有4％。免疫紊亂被認(rèn)為是類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎主要的發(fā)病機(jī)制，是以活化的CD4+T細(xì)胞和MHC-Ⅱ型陽性的抗原遞呈細(xì)胞(antigen presentingcell，APC)浸潤滑膜關(guān)節(jié)為特點(diǎn)的。在病程中T細(xì)胞和滑膜的巨噬細(xì)胞受抗原的刺激而活化，TNF

3、-α、IL-1、IL-6、IL-8等細(xì)胞因子增多，關(guān)節(jié)滑膜處于持續(xù)增生炎癥狀態(tài)。炎癥破壞關(guān)節(jié)軟骨和骨，造成關(guān)節(jié)畸形。IL-1、IL-6等引起類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎全身性癥狀如低熱、乏力、急性期蛋白合成增多，C反應(yīng)蛋白和血沉升高。生物制劑如IL-1拮抗劑，IL-6，及TNF-α拮抗劑，CTLA4和CD20單克隆抗體等，在國內(nèi)外逐漸用于治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，臨床試驗(yàn)提示它們有抗炎及防止骨破壞的作用。細(xì)胞因子通過激活Janus激酶/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子(

4、Januskinase/signal transducer and activator of transcription，JAK/STAT)途徑而發(fā)揮作用，而細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子家族(SOCS)是JAK/STAT通路唯一的反饋抑制因子，又被稱為細(xì)胞的“分子剎車”，在維持機(jī)體免疫自穩(wěn)中發(fā)揮重要作用。細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子家族一共有8個(gè)成員，包括細(xì)胞因子誘導(dǎo)SH2結(jié)構(gòu)域結(jié)合蛋白(CIS)和SOCS1-7。這些家族成員都是細(xì)胞內(nèi)的一種信

5、號(hào)調(diào)節(jié)蛋白，結(jié)構(gòu)相似，氨基端(N末端)是不同長度的可變區(qū)域，中間是一個(gè)SH2結(jié)構(gòu)域，羧基端(C末端)是一段保守序列，約40個(gè)氨基酸大小的SOCS盒子。人類SOCS3作為SOCS家族一員，最早發(fā)現(xiàn)于1997年，基因在染色體上的位置為17q25.3，有兩個(gè)包含2729個(gè)核苷酸的外顯子組成。外顯子2編碼序列由678個(gè)連續(xù)核苷酸組成，編碼225個(gè)氨基酸。SOCS3是細(xì)胞內(nèi)的一種信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白，正常情況下，SOCS3的mRNA在骨髓和脾等組織，以及

6、外周血細(xì)胞表達(dá)很低。但在細(xì)胞因子或其它刺激物誘導(dǎo)后，SOCS3的mRNA表達(dá)上調(diào)，其表達(dá)方式和時(shí)間因刺激因子和所在組織不同而改變。單核苷酸多態(tài)性(single nucleotidepolymorphism，SNP)系指人類基因組中大量存在的單個(gè)核苷酸的差異.核苷酸序列的一定差異決定了不同人種和不同個(gè)體的差異，以及不同人群疾病易感性和藥物治療敏感性的差異。因此，SNP是一個(gè)具有高度穩(wěn)定性的遺傳學(xué)標(biāo)記，可以成為尋找疾病相關(guān)基因，進(jìn)行疾病診斷

7、、預(yù)防和藥物篩選的基礎(chǔ)。目前，對(duì)SNP的檢測(cè)方法多種多樣，如限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性(RFLP)、單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)、等位基因特異性擴(kuò)增(ASA)和質(zhì)譜法等。四引物擴(kuò)增受阻突變體系PCR(tetra-primer amplification refractory mutation systemPCR，tetra-ARMS-PCR)方法擴(kuò)增的338bp片段的一級(jí)結(jié)構(gòu)特征是GC含量高達(dá)77％。GC含量高，Tm值就高。高GC含量模板

8、擴(kuò)增必須用耐熱性DNA聚合酶。SNP中其3’端正好與SNP位點(diǎn)重合，由引物的3’端控制著引物的延伸反應(yīng)，根據(jù)延伸產(chǎn)物的長度確定SNP類型。為提高SNP測(cè)定的特異性，在特異性引物的3’端倒數(shù)第3個(gè)堿基引入了一個(gè)人為錯(cuò)配堿基，當(dāng)錯(cuò)配堿基數(shù)目達(dá)到一定程度同時(shí)反應(yīng)條件達(dá)到一定的嚴(yán)謹(jǐn)程度時(shí)，3’末端堿基因磷酸二酯鍵形成困難而不能延伸，反應(yīng)終止，得不到特異條帶，表明沒有與之相應(yīng)的突變，反之則有。所以必須使用缺少3’→5’外切酶活性的Taq DNA聚

9、合酶。設(shè)計(jì)4條引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中F1F2外引物(F1：C-920A-o-F：5’CCG CGC TCA GCC TTT CTC TGC TGC GA3’；F2：C-920A-o-R：5’AGT CCA CAA AGG AGC CTT CGC GCG CG3’)用于擴(kuò)增一段含有SNP位點(diǎn)的338bp片段，另一對(duì)N1N2內(nèi)引物(N1：C-920A-i-F：5’CCC GCACGC AGC CAG CCG TCC3’；N2：C-920A

10、-i-R：5’AGC TGG GCC GGG CGG GCG ACT3’)為SNP位點(diǎn)特異性引物，4條引物在單管中同時(shí)進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，根據(jù)延伸產(chǎn)物的長度確定SNP的類型。其中F1F2擴(kuò)增的338bp片段，是必須出現(xiàn)的條帶；F1N2是210bp，基因型是A；F2N1是170bp，基因型是C。
　　 我們研究中國漢族人群SOCS35’非翻譯區(qū)(外顯子2)內(nèi)的-920 C>A(rs12953258)和啟動(dòng)子區(qū)的-1044C>A的單

11、核苷酸多態(tài)性，以及兩個(gè)基因位點(diǎn)是否存在連鎖不平衡(PDT)，即SOCS3的編碼序列(-920 C>A)和啟動(dòng)子區(qū)(-1044C>A)的連鎖關(guān)系。
　　 目的：
　　 研究SOCS3的-1044C>A(外顯子2的ATG上游堿基)和-920 C>A(rs12953258)兩個(gè)位點(diǎn)在中國漢族人群的突變頻率，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者和健康對(duì)照是否存在差異，以及兩個(gè)位點(diǎn)有無連鎖不平衡(PDT)，對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制和診斷有重要意義。<

12、br>　　 方法：
　　 1.實(shí)驗(yàn)組類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者100例，全部符合美國風(fēng)濕病學(xué)院(ACR)1987類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的分類標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)照組健康漢族人100例，性別及年齡相匹配。記錄其臨床資料，并收集抗凝的外周血2ml。
　　 2.提取DNA。
　　 3.四引物擴(kuò)增受阻突變體系PCR檢測(cè)SOCS3的-920 C>A(rs12953258)位點(diǎn)，用限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性(RFLP)檢測(cè)SOCS3的-1044C>A位點(diǎn)

13、。電泳，根據(jù)電泳條帶描述基因型。
　　 4.測(cè)序。
　　 結(jié)果：
　　 1.100名類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者中82名類風(fēng)濕因子陽性。
　　 2.SOCS3的-920 C>A(rs12953258)位點(diǎn)，中國漢族人群類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者基因型CC3％，AC89％，AA8％；健康對(duì)照組基因型CC9％，AC82％，AA9％。
　　 3.SOCS3的-1044C>A位點(diǎn)，中國漢族人群類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者基因型CC100％

14、，ACO％，AAO％；健康對(duì)照組基因型CC100％，ACO％，AAO％。
　　 4.200名中國漢族人群SOCS3的編碼序列(-920 C>A)和啟動(dòng)子區(qū)(-1044C>A)的連鎖關(guān)系，PDT顯示了沒有傳遞不平衡。
　　 結(jié)論：
　　 1.100名類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者中82名類風(fēng)濕因子陽性，其中女性67名基因型是AC59AA6CC2，男性15名基因型是AC12AA2CC1，共計(jì)82名基因型是AC71AA8CC3。

15、r>　　 2.丹麥后裔的高加索人群SOCS3的-920 C>A(rs12953258)基因型CC92％，ACO％，AA8％。而中國漢族人群類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者基因型CC3％，AC89％，AA8％；健康對(duì)照組基因型CC9％，AC82％，AA9％。說明人種差異。
　　 3.丹麥后裔的高加索人群SOCS3的-1044C>A基因型CC99％，ACO％，AA1％。而中國漢族人群類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者基因型CC100％，ACO％，AAO％，健康對(duì)照