中國(guó)漢族人類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎易感基因及Th17細(xì)胞的研究.pdf

1、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid Arthritis，RA)是一種系統(tǒng)性自身免疫性疾病，以關(guān)節(jié)的炎癥為主要特點(diǎn)，主要的病理變化為慢性滑膜炎和血管炎，當(dāng)累及關(guān)節(jié)軟骨和骨質(zhì)時(shí)，逐漸形成關(guān)節(jié)畸形和強(qiáng)直，導(dǎo)致關(guān)節(jié)功能喪失。在我國(guó)的患病率約為0.4％。RA的病因尚不明確，遺傳、環(huán)境和免疫因素共同發(fā)揮作用。 RA作為一種具有遺傳傾向的多基因性疾病，遺傳率高達(dá)53-65％，同卵雙胞胎患病的相對(duì)危險(xiǎn)度為2-12，而MHC在整個(gè)遺傳效應(yīng)中作用約

2、占30％。目前已知的RA的易感基因包括：HLA-DR，PTPN22，TNFAIP3和STAT4等，但還有一半以上的易感基因和多態(tài)性位點(diǎn)未被發(fā)現(xiàn)。此外，RA的遺傳特征具有明顯的異質(zhì)性，在主要的種族尤其是白種人和亞洲人之間，遺傳學(xué)研究的結(jié)果常常不一致。之前高加索人的全基因組掃描發(fā)現(xiàn)了大量潛在的危險(xiǎn)等位基因，需要在不同的種族中進(jìn)行驗(yàn)證。 Th17細(xì)胞作為一個(gè)新型的輔助性T細(xì)胞亞群，其分化、發(fā)育和功能均受其特定的細(xì)胞因子調(diào)控，能產(chǎn)生IL

3、-17A，IL-17F和IL-22等細(xì)胞因子。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Th17細(xì)胞在清除病原體感染和誘導(dǎo)自身免疫性炎癥中發(fā)揮著重要作用，同時(shí)有資料顯示一些自身免疫病患者如炎性腸病、多發(fā)性硬化和銀屑病等，存在著Th17細(xì)胞數(shù)量和(或)功能異常。 本研究擬通過大樣本的病例一對(duì)照相關(guān)性研究，在中國(guó)漢族人群中對(duì)之前已報(bào)道的與高加索人RA相關(guān)的基因位點(diǎn)和可能存在種族差異的易感基因的多態(tài)性進(jìn)行鑒定；此外，觀察RA患者外周血Th17細(xì)胞數(shù)量和功能的變化

4、，以及抗TNF-α治療對(duì)該細(xì)胞亞群的影響，探討RA的發(fā)病機(jī)制和治療機(jī)理。 第一部分中國(guó)漢族人類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎易感基因的大樣本研究 目的：在中國(guó)漢族人群中對(duì)已報(bào)道過的與高加索人RA相關(guān)的基因變異體或可能存在種族差異的易感基因的多態(tài)性進(jìn)行鑒定，包括了IL2RA、PAD14、IL2RB、CDK6、TRAF1、STAT4、IL2、IL21、CTLA4、MMEL1、PTPN22等16個(gè)基因的142個(gè)SNPs位點(diǎn)。 方法：以82

5、1例中國(guó)漢族RA患者和1000例種族相匹配的健康正常人為研究對(duì)象。應(yīng)用多重PCR和基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)技術(shù)，對(duì)142個(gè)SNPs位點(diǎn)進(jìn)行了基因分型。應(yīng)用Haploview4.1軟件進(jìn)行SNPs與疾病的關(guān)聯(lián)分析，連鎖不平衡和單倍體相關(guān)性分析。 結(jié)果：?jiǎn)蝹€(gè)SNPs位點(diǎn)與RA關(guān)聯(lián)分析顯示：在中國(guó)漢族RA患者中，STAT4的2個(gè)位點(diǎn)(rs11685878和rs7574070)等位基因頻率及基因型頻率

6、與對(duì)照組有顯著性差異(P=0.0459和0.0045、0.0007和0.0005)；CDK6的rs42041等位基因頻率及基因型頻率在RA組和對(duì)照組有顯著性差異(P=0.0199，0.018)；位于PAD14的4個(gè)位點(diǎn)(rs1886302、rs2477131、rs11203326和rs1635561)等位基因頻率和基因型頻率與對(duì)照組均無顯著性差異(P＞0.05)；IL2RB的rs228979等位基因頻率及基因型頻率在病例組和對(duì)照組存在顯

7、著差異(P=0.0043，0.0112)；IL21的rs2221903等位基因頻率及其基因型頻率與健康對(duì)照組有顯著性差異(P=0.0273，0.0478)。連鎖不平衡和單倍體關(guān)聯(lián)性分析發(fā)現(xiàn)，CDK6基因rs42041/rs42042組成的單倍體CT、單倍體GT在RA患者和對(duì)照組間存在顯著性差異(P=0.0322，0.0263)；STAT4基因rs11685878/rs/7574070組成的單倍體TA、單倍體CC在RA患者和對(duì)照組之間存在

8、顯著性差異(P=0.0167，0.0019)。此外結(jié)果還顯示，MMEL1基因與RA具有很強(qiáng)的關(guān)聯(lián)性，PTPN22基因與RA無相關(guān)性。 結(jié)論：IL-21很有可能是中國(guó)漢族人RA的易感基因。CDK6、STAT4和MMEL1是不同種族中RA共同的非MHC易感基因。在中國(guó)漢族人群中PTPN22基因與RA無相關(guān)性。 第二部分 Th17細(xì)胞與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎相關(guān)性的研究 第一節(jié) RA患者外周血Th17細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)

9、 目的：Th17細(xì)胞的分化發(fā)育以及功能的發(fā)揮依賴于特定的細(xì)胞因子。通過檢測(cè)血清中IL-17、IL-23、IL-1β、IL-6以及TGFβ-1的蛋白含量，以及PBMC相應(yīng)細(xì)胞因子mRNA的表達(dá)水平，研究RA患者外周血Th17細(xì)胞的功能狀況。 方法：選擇RA患者74例并按照疾病活動(dòng)性分組，正常對(duì)照者82例。運(yùn)用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定以及實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，分別從蛋白和mRNA水平對(duì)外周血中IL-17、IL-23、IL-1β、IL-6

10、以及TGFβ-1進(jìn)行檢測(cè)。 結(jié)論：在活動(dòng)期RA患者體內(nèi)，Th17細(xì)胞的主要效應(yīng)性細(xì)胞因子IL-17水平明顯升高，并與疾病活動(dòng)性相關(guān)；促進(jìn)初始CD4+T細(xì)胞向Th17細(xì)胞分化的細(xì)胞因子IL-1β、IL-6以及TGFβ-1的水平也明顯升高，這些結(jié)果均提示活動(dòng)性RA患者外周血中Th17細(xì)胞功能活躍。而IL-23主要是維持Th17細(xì)胞的存活和擴(kuò)增，其功能的發(fā)揮無“劑量依賴性”。 第二節(jié) RA患者外周血Th17細(xì)胞的比例以及在體外

11、不同微環(huán)境中的分化狀態(tài) 目的：IL-17是Th17細(xì)胞標(biāo)志性的細(xì)胞因子。通過檢測(cè)CD4+IL-17+T細(xì)胞的比例研究RA患者外周血Th17細(xì)胞的數(shù)量。同時(shí)，觀察在體外不同的細(xì)胞因子微環(huán)境對(duì)Th17細(xì)胞分化的影響。 方法：選擇活動(dòng)性RA患者10例，緩解期RA患者8例，正常對(duì)照10例。Ficoll密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，用佛波酯和鈣離子載體刺激5小時(shí)后，抗CD4-FITC和抗IL-17-PE標(biāo)記，流式

12、細(xì)胞儀檢測(cè)CD4+IL-17+T細(xì)胞的比例。將分離出的一部分PBMC加入不同的細(xì)胞因子微環(huán)境(IL-1βD+IL-6、IL-1β+IL23、IL-6+IL23、IL-1β+IL23+IL-6、TGF-β)體外培養(yǎng)5天，抗CD4-FITC和抗IL-17-PE標(biāo)記，流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD4+IL-17+T細(xì)胞的比例。 結(jié)論： RA患者外周血Th17細(xì)胞的數(shù)量增多，并且與疾病活動(dòng)性有關(guān)。在體外，細(xì)胞因子IL-1β加IL-6可有效的刺激人T

13、h17細(xì)胞分化，誘導(dǎo)IL-17的表達(dá)。 第三節(jié)抗TNF-α治療對(duì)Th17細(xì)胞數(shù)量和功能的影響 目的：觀察活動(dòng)期RA在接受人源化抗TNF-α單克隆抗體(adalimumab)治療后，其外周血Th17細(xì)胞數(shù)量和功能的變化情況。研究抗TNF-α抗體發(fā)揮治療作用的機(jī)制。 方法：選取參加Adalimumab藥物臨床試驗(yàn)的活動(dòng)期RA患者7例，隨訪6個(gè)月。應(yīng)用熒光定量PCR檢測(cè)治療前后外周血Th17相關(guān)的細(xì)胞因子mRNA的變化

14、，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)治療前后外周血中CD4+IL-17+T細(xì)胞比例的改變。 結(jié)論：Adalimumab能夠直接中和TNF-α，使得位于TNF-α下游的IL-11β和IL-6水平降低，同時(shí)adalimumab有效地降低了RA患者PBMC中IL-23mRNA的表達(dá)水平，這可能是抗TNF-α抗體的又一種治療機(jī)制。Adalimumab對(duì)Th17細(xì)胞的數(shù)量和效應(yīng)因子IL-17的水平?jīng)]有直接的影響。由此推測(cè)，TNF-α抑制劑和以Th17細(xì)胞為靶