四妙勇安湯合生脈飲對(duì)缺氧乳鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響.pdf

1、目的:研究四妙勇安湯合生脈飲對(duì)缺氧/復(fù)氧損傷后原代培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞的影響，探討四妙勇安湯合生脈飲對(duì)缺氧/復(fù)氧損傷后原代培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響。
　　 方法:本研究應(yīng)用醇沉技術(shù)制備四妙勇安湯合生脈飲的藥液，采用胰蛋白酶和膠原酶聯(lián)合消化的方法分離SD乳鼠心肌細(xì)胞，采取兩次差速貼壁法對(duì)心肌細(xì)胞進(jìn)行純化，原代培養(yǎng)，建立細(xì)胞模型，倒置相差顯微鏡下觀察原代培養(yǎng)的心肌細(xì)胞，不同時(shí)間下對(duì)細(xì)胞形態(tài)拍照并錄像，利用免疫細(xì)胞化學(xué)方法對(duì)心肌細(xì)胞進(jìn)行

2、純度鑒定。利用高純氮?dú)饨⑿募〖?xì)胞缺氧/復(fù)氧模型，制備細(xì)胞缺氧用的密閉方盒，自制缺氧盒有進(jìn)氣口和出氣口，先用注射器自出氣口盡量抽真空，再自進(jìn)氣口向缺氧盒中充高純氮?dú)?0-40min，置換盒中的氧氣，關(guān)閉缺氧盒的進(jìn)氣口與出氣口，缺氧時(shí)間4h，復(fù)氧時(shí)間2h。原代培養(yǎng)的乳鼠心肌細(xì)胞隨機(jī)分為三組。正常對(duì)照組(control group):不進(jìn)行缺氧/復(fù)氧的處理，不更換培養(yǎng)液，也不加四妙勇安湯合生脈飲的醇沉藥液進(jìn)行干預(yù);模型組(model gro

3、up):進(jìn)行缺氧/復(fù)氧的處理，更換無糖無血清培養(yǎng)液，但不加四妙勇安湯合生脈飲的醇沉藥液;藥物干預(yù)組(treatment group):進(jìn)行缺氧/復(fù)氧的處理，更換無糖無血清培養(yǎng)液，加四妙勇安湯合生脈飲的醇沉藥液進(jìn)行干預(yù)。實(shí)驗(yàn)開始時(shí)正常對(duì)照組更換完全培養(yǎng)基入培養(yǎng)箱培養(yǎng)6h;模型組、藥物干預(yù)組更換無糖無血清培養(yǎng)液，缺氧培養(yǎng)4h，隨后模型組更換完全培養(yǎng)基，藥物干預(yù)組更換含有10％四妙勇安湯合生脈飲醇沉藥液的完全培養(yǎng)基，復(fù)氧2h，根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

4、用于實(shí)驗(yàn)。采用MTT比色法檢測(cè)心肌細(xì)胞存活力，采用全自動(dòng)生化自動(dòng)儀檢測(cè)心肌細(xì)胞培養(yǎng)液AST的含量，采用流式細(xì)胞術(shù)Annexin V-FITC/PI雙染法檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡率，比較各組心肌細(xì)胞存活力、AST含量、心肌細(xì)胞凋亡率的情況，從而得出四妙勇安湯合生脈飲對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的影響結(jié)果。
　　 結(jié)果:
　　 (1)原代培養(yǎng)的乳鼠心肌細(xì)胞在倒置相差顯微鏡下觀察，接種時(shí)心肌呈懸浮狀態(tài)，最早在6小時(shí)內(nèi)觀察到心肌細(xì)胞貼壁并搏動(dòng)，心肌細(xì)

5、胞逐漸伸展為三角狀、梭形狀、菱形狀、多角形狀等多種不規(guī)則形狀，24小時(shí)內(nèi)大部分心肌細(xì)胞搏動(dòng)，但搏動(dòng)頻率不同，48小時(shí)后見心肌細(xì)胞相互連接，搏動(dòng)頻率趨于一致，第5天見心肌細(xì)胞鋪展成片搏動(dòng)頻率基本一致，應(yīng)用免疫組織化學(xué)的方法經(jīng)鑒定為心肌細(xì)胞。
　　 (2)四妙勇安湯合生脈飲對(duì)缺氧乳鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響:
　　 ①M(fèi)TT比色法檢測(cè)心肌細(xì)胞存活力:正常對(duì)照組OD值為(0.274±0.012)，模型組OD值為(0.189±0.02

6、0)，藥物干預(yù)組OD值為(0.223±0.018)。模型組與正常對(duì)照組比較，OD值明顯降低，說明模型組心肌細(xì)胞活細(xì)胞的數(shù)量明顯減少，藥物干預(yù)組與正常對(duì)照組比較，OD值也降低，藥物干預(yù)組與模型組比較，OD值增高，說明藥物干預(yù)組能提高各孔的OD值，心肌細(xì)胞活細(xì)胞數(shù)量雖然較正常對(duì)照組減少，但是較模型組并未減少。經(jīng)單因素方差分析，模型組、藥物干預(yù)組與正常對(duì)照組比較差異具有顯著性(P＜0.05)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;藥物干預(yù)組與模型組比較差異具有顯著性

7、，也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 ②心肌細(xì)胞培養(yǎng)液中天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶AST含量的檢測(cè):在缺氧/復(fù)氧實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，留取正常對(duì)照組、模型組、藥物干預(yù)組各個(gè)組心肌細(xì)胞培養(yǎng)液樣本檢測(cè)，正常對(duì)照組AST含量為(1.02±0.45)，模型組AST含量(3.96±0.88)，藥物干預(yù)組AST含量(2.55±0.67)，模型組AST含量較正常對(duì)照組升高，而在加入四妙勇安湯合生脈飲醇沉藥液的藥物干預(yù)組AST含量較模型組降低，但是較正常對(duì)照

8、組仍升高。經(jīng)單因素方差分析，模型組、藥物干預(yù)組與正常對(duì)照組相比較，差異具有顯著性，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);藥物干預(yù)組與模型組相比較，差異具有顯著性，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 ③流式細(xì)胞術(shù)Annexin V-FITC/PI雙染法檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡:從FITC和PI熒光標(biāo)記的雙參數(shù)點(diǎn)圖做統(tǒng)計(jì)分析觀察到，正常對(duì)照組處于正常條件培養(yǎng)的心肌細(xì)胞即有細(xì)胞凋亡的存在，凋亡率為(13.02±0.65)％;模型組缺氧/復(fù)氧條件下培

9、養(yǎng)的心肌細(xì)胞凋亡率為(28.56±0.92)％;藥物干預(yù)組給四妙勇安湯合生脈飲干預(yù)的心肌細(xì)胞凋亡率為(16.74±0.83)％。經(jīng)單因素方差分析，各組比較，差異有顯著性，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:四妙勇安湯合生脈飲對(duì)缺氧乳鼠心肌細(xì)胞凋亡具有保護(hù)作用，其作用可能與四妙勇安湯合生脈飲能夠提高缺氧/復(fù)氧損傷后心肌細(xì)胞的存活力、能夠降低缺氧/復(fù)氧損傷后心肌細(xì)胞培養(yǎng)液中AST含量有關(guān)，改善心肌細(xì)胞能量代謝及維持心肌細(xì)胞