大菱鲆信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子1(STAT1)和牙鲆干擾素調(diào)節(jié)因子9(IRF9)全長(zhǎng)cDNA克隆與表達(dá)分析.pdf

1、大菱鲆(Scophthalmus maximus)和牙鲆(Paralichthys olivaceus)是我國(guó)沿海和北方地區(qū)重要的海水養(yǎng)殖魚(yú)類品種。近年來(lái),隨著海水養(yǎng)殖不斷迅速發(fā)展,不僅帶動(dòng)了我國(guó)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展,也增加了勞動(dòng)就業(yè)機(jī)會(huì),緩解了人口食物需求對(duì)陸地農(nóng)業(yè)的壓力,但隨之更深層次問(wèn)題陸續(xù)出現(xiàn),發(fā)展的越來(lái)越嚴(yán)重,尤其病毒性疾病,給海水養(yǎng)殖的經(jīng)濟(jì)利益帶來(lái)了嚴(yán)重的不利影響。干擾素(interferons,IFN)在抗病毒免疫過(guò)程中具有重要的作

2、用,因此,對(duì)大菱鲆和牙鲆干擾素系統(tǒng)中的有關(guān)的基因的深入研究具有不可估量的重大意義。
　　該研究分別采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)、同源PCR克隆(Homology PCR Cloning)和cDNA末端快速擴(kuò)增(Rapid Amplification of cDNA ends,RACE)技術(shù),從大菱鲆和牙鲆脾臟組織中分別獲得STAT1(transcription factors signal transducers a

3、nd activators of transcription1)和IRF9(Interferon regulatory factors9)基因的全長(zhǎng)cDNA序列。STAT1涉及Ⅰ和Ⅱ IFN信號(hào)通路,在實(shí)驗(yàn)研究中成功克隆的大菱鲆 STAT1有3種不同的cDNA變異體(全長(zhǎng)分別為3072 bp,2970 bp和2960 bp),它們僅僅在3’非翻譯區(qū)( untranslated region,UTR)不同。序列分析表明,cDNAs是由不同

4、的加尾位點(diǎn)形成。STAT1 cDNA所編碼的750個(gè)氨基酸,與其他魚(yú)類的STAT1s具有58.8-92.7％的一致性,并且擁有DBD(DNA binding domain), SH2(SH2 domain), TAD(transcriptional activation domain)區(qū)域。本文克隆的另一基因牙鲆IRF9,cDNA長(zhǎng)3305 bp,包括272 bp5’-UTR,1725 bp3’-UTR,編碼435個(gè)氨基酸殘基包含有 D

5、BD,IAD(IRF association domain),NLS(nuclear localization signal),PRD(proline-rich domain)等區(qū)域。牙鲆IRF9的序列同其他魚(yú)類具有33.7-72.0%的一致性和61.9-80.5%的相似性。
　　定量PCR分析大菱鲆STAT1和牙鲆 IRF9在12種組織中即腦、鰓、胃、腸、心、頭腎、體腎、肝、脾、性腺、肌肉和皮膚組織的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明都呈組成型

6、表達(dá),大菱鲆STAT1在腸,頭腎,肝臟,脾臟組織中表達(dá)量較高;牙鲆 IRF9在頭腎,腎,肝臟,脾臟組織中的表達(dá)量較高。
　　此外,我們還利用定量PCR研究了大菱鲆STAT1受到poly I:C和TRBIV誘導(dǎo)后在0h,3h,6h,12h,1d,2d,3d,4d,5d,7d時(shí)間點(diǎn),牙鲆IRF9分別在0h,3h,6h,12h,1d,2d,3d,4d,5d,7d時(shí)間點(diǎn)受到polyI:C和在0h,6h,12h,18h,1d,2d,3d,4

7、d,5d,7d時(shí)間點(diǎn)受到LCDV誘導(dǎo)后的動(dòng)力學(xué)表達(dá)模式。實(shí)驗(yàn)表明大菱鲆STAT1和牙鲆IRF9在受到外源刺激的7d早期階段,poly I:C均是快速的誘導(dǎo)者。在分別受到2種外源刺激后,大菱鲆 STAT1和牙鲆IRF9表達(dá)最強(qiáng)烈,最快的均是脾臟組織。就poly I:C誘導(dǎo)而言,大菱鲆STAT1在脾,腎臟,鰓,肌肉的最高表達(dá)量為2.7-,3.9-,4.2-和4.4倍。此外,鰓和脾臟組織分別在5 d,3 d時(shí)間點(diǎn)出現(xiàn)弱峰,表達(dá)量分別是2.8和

8、3.5倍。而牙鲆IRF9除了在脾臟中有所表達(dá),在其他組織中的表達(dá)微弱,脾,鰓,頭腎,肌肉中的表達(dá)量分別是8.6-,1.4-,1.3-和2倍;這些結(jié)果表明 STAT1和 IRF9均參與到了宿主的抗病毒免疫反應(yīng)中。就大菱鲆受 TRBIV誘導(dǎo)而言, STAT1基因表達(dá)最高量在鰓,頭腎,脾和肌肉中分別在2 d,1 d,3 d,5 d以表達(dá)量3.4倍,3.5倍,4.5倍和2倍出現(xiàn);而頭腎和脾臟中5 d,3 d出現(xiàn)第2波峰,表達(dá)量分別為2.9倍和4