信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子5A(STAT5A)的丟失對肝癌糖代謝的影響及其機(jī)制探究.pdf

1、研究目的:
　　信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子5（Signal Transducer and Activator Of Transcription5，STAT5）在人體內(nèi)有著廣泛的生理病理功能。STAT5能被多種細(xì)胞因子(cytokines)如催乳激素(prolactin，Prl)、紅細(xì)胞生長素(erythropoietin)、生長激素(growth hormone，GH)和上皮生長因子(epidermal growth factor，E

2、GF)等激活并能反饋的調(diào)控多種細(xì)胞因子。在肝臟中，有研究發(fā)現(xiàn)GH-STAT5信號通路在控制脂代謝途徑上發(fā)揮著重要的作用:肝臟特異性敲除STAT5后，增加了CD36和PPAR(Peroxisome Proliferator Activated Receptor)的表達(dá)，導(dǎo)致實驗小鼠出現(xiàn)明顯的脂肪肝、葡萄糖耐受不良、胰島素抵抗和肝臟再生能力受損。此外STAT5在肝臟的缺失，還會引起TGF-β和STAT3的表達(dá)增加，加速了肝臟的纖維化和腫瘤的

3、形成。另外，肝特異性的敲除STAT5A后，調(diào)控了NOX4(reactive oxygen species(ROS)-generating enzyme NOX4)的表達(dá)，導(dǎo)致凋亡蛋白PUMA和BIM的表達(dá)下降，從而促進(jìn)了肝癌細(xì)胞增殖。
　　STAT5包含了STAT5A和STAT5B兩個亞型，二個亞型均由人類17號染色體上銜接的連鎖基因所編碼，并在DNA結(jié)構(gòu)上有95％的相似性，但是由于蛋白結(jié)構(gòu)上的反式激活區(qū)域存在著一定的差異，STA

4、T5A和STAT5B在生理病理過程中都有著特異的生物學(xué)功能。本課題旨在探究STAT5A亞型在肝癌進(jìn)展中的作用，尤其是對肝癌糖代謝的影響。同時，希望能從抑制糖代謝的角度尋找新的潛在的治療靶點。
　　研究方法:
　　首先，利用病人組織芯片，分析并明確STATSA在肝癌病人腫瘤組織中的表達(dá)情況。Kaplan-Meier方法分析STAT5A的表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系以及進(jìn)行多因素的生存分析。在生物學(xué)功能方面，首先構(gòu)建STAT5A過表達(dá)的穩(wěn)轉(zhuǎn)

5、Huh7肝癌細(xì)胞系，利用CCK8、流式分析及裸鼠皮下荷瘤實驗探索STAT5A對于肝癌細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的影響。然后，利用Kit檢測STAT5A的表達(dá)對于細(xì)胞葡萄糖消耗，乳酸代謝的影響。更進(jìn)一步憑借GC-MS技術(shù)，具體的分析糖酵解和TCA循環(huán)上各代謝產(chǎn)物的變化。在機(jī)制方面，利用q-PCR技術(shù)和Wectern blot技術(shù)分析驗證STAT5A可能的作用通路以及作用的糖代謝靶點。
　　研究結(jié)果:
　?。ㄒ唬㏒TAT5A的表達(dá)與患者

6、預(yù)后的關(guān)系
　　1.根據(jù)148例病人的組織芯片結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，與配對癌旁組織相比，STAT5A在肝癌腫瘤組織中的表達(dá)明顯降低。用Kaplan-Meier生存分析方法分析發(fā)現(xiàn)，腫瘤中STAT5A低表達(dá)組OS較高表達(dá)組明顯降低。多因素生存分析也有類似的結(jié)果:STAT5A的表達(dá)與是否有包膜、AFP的表達(dá)和腫瘤大小可以作為影響RFS和OS的獨立風(fēng)險因素。
　?。ǘ㏒TAT5A在體內(nèi)外對肝癌細(xì)胞增殖能力、細(xì)胞周期的影響
　　1.

7、檢測STAT5A在常用肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)，挑選Huh7構(gòu)建了穩(wěn)轉(zhuǎn)的過表達(dá)細(xì)胞系，而敲除STAT5A的細(xì)胞系則用相對應(yīng)的siRNA，并用WB對STAT5A的表達(dá)進(jìn)行驗證。
　　2.CCK8增殖實驗發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)STAT5A后肝癌細(xì)胞的增殖明顯被抑制，而敲除STATSA之后細(xì)胞的增殖能力明顯增強(qiáng)。裸鼠皮下荷瘤實驗也證實了STAT5A能抑制肝癌細(xì)胞的增殖。流式技術(shù)分析還發(fā)現(xiàn)，STAT5A過表達(dá)可以抑制肝癌細(xì)胞的周期進(jìn)展，使肝癌細(xì)胞更多的停

8、滯在G0/G1期，減少了細(xì)胞的有絲分裂。
　　3.關(guān)于糖代謝方面，首先利用相關(guān)kit檢測培養(yǎng)基葡萄糖和乳酸，發(fā)現(xiàn)STAT5A過表達(dá)可以明顯的減少肝癌細(xì)胞葡萄糖的消耗和乳酸的產(chǎn)生。進(jìn)一步的針對具體代謝產(chǎn)物的分析提示，STAT5A過表達(dá)可以降低糖酵解和TCA循環(huán)上的主要產(chǎn)物。
　　（三）STAT5A機(jī)制探究
　　1.在通路方面，發(fā)現(xiàn)STAT5A可以明顯的調(diào)控AKT的磷酸化，而反過來抑制AKT之后STAT5A的磷酸化也會增加

9、。配對病人的組織芯片結(jié)果也證實，STAT5A的表達(dá)與p-AKT的表達(dá)呈負(fù)性相關(guān)。
　　2.利用knock-down和過表達(dá)的細(xì)胞進(jìn)行qPCR檢測發(fā)現(xiàn)STAT5A在轉(zhuǎn)錄水平能影響多種基因的表達(dá)，在病人組織的RNA水平上也有類似的結(jié)果。進(jìn)一步的WB實驗發(fā)現(xiàn)，STAT5A會明顯的影響HK2的蛋白水平的表達(dá)。加入AKT抑制劑之后能逆轉(zhuǎn)HK1的蛋白表達(dá)證實，AKT通路在STAT5A-HK2的調(diào)控過程中有著重要的作用。
　　3.發(fā)現(xiàn)了m

10、iRNA-23a可以負(fù)調(diào)控STAT5A的表達(dá)。
　　4.此外，還證實了，STAT5A對另一個重要的轉(zhuǎn)錄因子HNF4α有著明顯的正調(diào)控，并且，HNF4α可以直接作用于PI3K。
　　研究結(jié)論:
　　本課題首先明確了STAT5A在肝癌患者腫瘤組織中低表達(dá)，并且低表達(dá)組預(yù)后較差。接著在細(xì)胞學(xué)以及動物水平上驗證了STAT5A能明顯抑制細(xì)胞的增殖和細(xì)胞周期的進(jìn)展，發(fā)揮著重要的抑癌作用。關(guān)于糖代謝方面，發(fā)現(xiàn)STAT5A的過表達(dá)可以