TGF-α、EGFR及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3在喉癌組織中的表達(dá)及相關(guān)性研究.pdf

1、喉癌是常見(jiàn)的頭頸部惡性腫瘤，在世界范圍內(nèi)，喉癌的發(fā)病率居于全身惡性腫瘤的第十一位。目前，手術(shù)和放射治療仍然是治療喉癌的主要手段;化學(xué)治療對(duì)局部控制率的提高和預(yù)后的改善作用尚需進(jìn)一步的研究。在過(guò)去的幾十年，隨著各種喉功能保留措施的應(yīng)用，喉全切除術(shù)的應(yīng)用正在逐漸減少，但是喉癌的生存率沒(méi)有大的提高。因此，進(jìn)一步研究喉癌發(fā)生、發(fā)展的分子生物學(xué)機(jī)制，發(fā)現(xiàn)其腫瘤標(biāo)志物及臨床意義，對(duì)于喉癌的預(yù)防、診斷、預(yù)后評(píng)價(jià)和化療藥物選擇將有重大的意義。
　

2、　 表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)具有酪氨酸蛋白激酶(PTK)活性，其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的異常與腫瘤增殖、浸潤(rùn)、細(xì)胞遷移、血管生成、抗凋亡有關(guān)。EGFR是TGF-a和EGF的共同受體，但EGF的活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于TGF-α。EGFR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路主要有:Ras/Raf/MEK/ERK/MAPK通路、PI3K/PDK1/Akt(PKB)通路、PLC-γ通路、JAK/STAT通路。Stat3是STATs家族的重要成員。Stat3蛋白在細(xì)胞質(zhì)中呈潛伏狀態(tài)，

3、通過(guò)酪氨酸磷酸化被激活，磷酸化Stat3形成同源或異源性二聚體，轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核，發(fā)揮促進(jìn)轉(zhuǎn)錄的作用。在正常細(xì)胞，Stat3的激活是個(gè)短暫的過(guò)程，只持續(xù)數(shù)分鐘至數(shù)小時(shí)。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)Stat3在人體多種原發(fā)腫瘤和細(xì)胞系中均有激活，并被定義為癌基因。目前，頭頸部鱗癌癌變的具體機(jī)制還不十分清楚，關(guān)于喉癌組織中TGF-α、EGFR/Stat3信號(hào)傳導(dǎo)通路情況相互關(guān)系，國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)專(zhuān)題報(bào)道。
　　 目的：為了明確喉癌組織中Stat3表達(dá)和激活

4、情況、活化的Stat3與TGF-α、EGFR表達(dá)關(guān)系。
　　 材料與方法：
　　 一、實(shí)驗(yàn)材料：
　　 收集2007年3月至2008年10月之間中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院耳鼻咽喉科62例喉癌手術(shù)標(biāo)本。對(duì)照組:選取其中的13例喉全切除術(shù)標(biāo)本中，距離腫瘤邊緣＞1.0cm的粘膜組織作為對(duì)照組。
　　 二、實(shí)驗(yàn)方法：
　　 (一)RT-PCR檢測(cè) EGFR mRNA、TGF-αmRNA和Stat3 mRNA

5、表達(dá)
　　 Trizol一步法提取總RNA。cDNA合成后進(jìn)行PCR擴(kuò)增EGFR基因引物序列為:5'-GCCAAGGCACGAGTAACAAG-C-3'(上游)，5'-AGGGCAATGAGGACATAACCAG-3'(下游)，擴(kuò)增長(zhǎng)度187bp;TGF-a基因引物序列為:5'-CAGGGTGCGGAGATGGAAC-3'(上游)，5'-CGAGGGCTCACGAGGAAGT-3'(下游)，擴(kuò)增長(zhǎng)度253bp;Stat3基因引物

6、序列為:5'-CACCAAGCGAGGACTGAGCAT-3'(上游)，5'-GCCAGACCCAGAAGGAGAAGC-3'(下游)，擴(kuò)增長(zhǎng)度149bp;β-actin引物序列為:5'-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3'(上游)，5'-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3’(下游)，擴(kuò)增長(zhǎng)度510bp。
　　 (二)Western印跡檢測(cè)EGFR、TGF-α、Stat3及p-Stat3蛋白表達(dá)

7、>　　 取組織塊提取細(xì)胞總蛋白，10％的 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)印后用EGFR、TGF-α、Stat3、p-Stat3和抗β-actin單克隆抗體孵育。加入用堿性磷酸酶標(biāo)記的相應(yīng)二抗，顯色后置于UVP-8000凝膠成像儀成像。
　　 (三)免疫組化檢測(cè)EGFR、TGF-α、Stat3、p-Stat3蛋白表達(dá)
　　 采用鏈霉菌抗生物素蛋白—過(guò)氧化酶連接(SP)免疫組織化學(xué)方法，實(shí)驗(yàn)步驟按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

8、　　 (四)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　 應(yīng)用SPSS11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，兩組均數(shù)比較時(shí)用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料采用x2檢驗(yàn);雙變量相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析。
　　 結(jié)果：
　　 1、免疫組化EGFR蛋白細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)均有著色;62例癌組織中陽(yáng)性77.4％，其中弱陽(yáng)性38.7％，中度陽(yáng)性21.0％，強(qiáng)陽(yáng)性17.7％;13例對(duì)照粘膜組織中陰性84.6％，弱陽(yáng)性15.

9、4％;二者之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=18.610，P=0.000)。
　　 2、Western印跡62例喉癌組織和13例對(duì)照組織中均有EGFR蛋白的表達(dá)，喉癌組織與對(duì)照組織中EGFR蛋白表達(dá)值分別為110.67±21.63和54.80±6.59，二者之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=9.178，P=0.001)。
　　 3、62例喉癌組織和13例對(duì)照組織中均有EGFR mRNA的表達(dá)。喉癌組織與對(duì)照組織中EGFR mRNA

10、表達(dá)值分別為70.49±17.09和31.99±2.99，二者之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=8.055，P=0.000)。
　　 4、免疫組化TGF-α蛋白細(xì)胞質(zhì)著色;62例癌組織中陽(yáng)性46.8％，其中弱陽(yáng)性22.6％，中度陽(yáng)性19.4％，強(qiáng)陽(yáng)性4.8％;13例對(duì)照粘膜組織92.3％為陰性，7.7％為弱陽(yáng)性;二者之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=6.839，P=0.009)。
　　 5、Western印跡62例喉癌組織和13例

11、對(duì)照組織中均有TGF-a蛋白的表達(dá)，喉癌組織與對(duì)照組織中TGF-α蛋白表達(dá)值分別為84.14±15.04和38.19±3.96，二者之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=10.879，P=0.000)。
　　 6、62例喉癌組織和13例對(duì)照組織中均有TGF-α mRNA的表達(dá)。喉癌組織與對(duì)照組織中TGF-α mRNA表達(dá)值分別為49.69±10.09和25.99±2.15，二者之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=8.383，P=0.000)。

12、r>　　 7、EGFR蛋白與TGF-a蛋白正相關(guān)，Pearson相關(guān)系數(shù)為0.896，顯著性檢驗(yàn)P=0.000。
　　 8、免疫組化Stat3蛋白細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核均有著色;62例癌組織中陽(yáng)性61.3％，其中弱陽(yáng)性25.8％，中度陽(yáng)性21.0％，強(qiáng)陽(yáng)性14.5％;13例對(duì)照粘膜組織均為陰性;二者之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=16.151，P=0.000)。
　　 9、免疫組化p-Stat3蛋白細(xì)胞核著色;62例癌組織中陽(yáng)性

13、43.5％，其中弱陽(yáng)性16.1％，中度陽(yáng)性19.4％，強(qiáng)陽(yáng)性8.1％;13例對(duì)照粘膜組織均為陰性;二者之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=8.846，P=0.003)。
　　 10、Western印跡62例喉癌組織和13例對(duì)照組織中均有Stat3、p-Stat3蛋白的表達(dá)，喉癌組織與對(duì)照組織中Stat3、p-StaG蛋白表達(dá)值分別為114.91±25.45和70.65±9.53、57.64±17.67和13.77±2.33，二者之間差

14、異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.152，P=0.000)和(t=8.890，P=0.000)。
　　 11、62例喉癌組織和13例對(duì)照組織中均有Stat3 mRNA的表達(dá)。喉癌組織與對(duì)照組織中Stat3 mRNA表達(dá)值分別為68.34±10.59和33.49±2.61，二者之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=11.721，P=0.000)。
　　 12、EGFR蛋白與p-Stat3蛋白正相關(guān)，Pearson相關(guān)系數(shù)為0.698，顯著性