馬多巴胺D4受體基因克隆、序列分析和多態(tài)性研究.pdf

1、本研究以不同類型馬為研究對(duì)象，利用PCR技術(shù)，首次克隆了6個(gè)類型馬包括完整4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子的多巴胺D4受體基因。其中三河馬的序列提交到了GenBank，登錄號(hào)為：EF561289。此外，對(duì)6個(gè)類型馬的多巴胺D4受體基因序列結(jié)構(gòu)、核苷酸組成及所編碼的氨基酸進(jìn)行了初步研究，并利用生物信息學(xué)方法對(duì)馬DRD4蛋白結(jié)構(gòu)、功能位點(diǎn)等進(jìn)行分析預(yù)測(cè)，同時(shí)采用PCR-SSCP技術(shù)、PCR-RFLP技術(shù)和PCR產(chǎn)物純化直接測(cè)序等方法對(duì)各類群馬DRD4

2、基因序列進(jìn)行了多態(tài)性分析。研究結(jié)果表明： 1、馬DRD4基因含有4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子，且不同類型馬第2外顯子、第3外顯子和第1內(nèi)含子的大小存在差異。 2、馬DRD4基因序列核苷酸組成富含GC，且外顯子GC含量明顯高于內(nèi)含子區(qū)域和全序列。馬與其它物種的DRD4基因密碼子3個(gè)位點(diǎn)核苷酸均偏向使用G和C。 3、馬DRD4基因編碼區(qū)對(duì)同義密碼子的使用表現(xiàn)有強(qiáng)烈的偏好性。 4、馬DRD4基因所編碼的20種氨基酸的

3、含量差異很大。丙氨酸(A)含量最高，為15.65％：賴氨酸(K)最低，為0.88％。非極性氨基酸含量(57.34％)高于極性氨基酸(42.66％)。 5、馬DRD4蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果表明，一級(jí)結(jié)構(gòu)由30個(gè)氨基酸組成的細(xì)胞外N．末端、7個(gè)a螺旋的跨膜結(jié)構(gòu)、3個(gè)胞內(nèi)環(huán)、3個(gè)胞外環(huán)和由17個(gè)氨基酸組成且位于胞內(nèi)的C末端。在二級(jí)結(jié)構(gòu)中發(fā)現(xiàn)，在不同類型馬DRD4蛋白中至少形成約12個(gè)α-螺旋、8個(gè)β-折疊、40個(gè)loop結(jié)構(gòu)，含18個(gè)功能位

4、點(diǎn)、7個(gè)低復(fù)雜區(qū)(LCRs)、一個(gè)不規(guī)則區(qū)(NORs)和5個(gè)二硫鍵，且其三級(jí)結(jié)構(gòu)為一典型的致密桶狀結(jié)構(gòu)。 6、PCR-SSCP分析結(jié)果表明，在所檢測(cè)的第1、第4外顯子及第2、第3內(nèi)含子區(qū)域均較保守，未發(fā)現(xiàn)任何多態(tài)現(xiàn)象。 7、PCR-RFLP分析結(jié)果表明，在第1內(nèi)含子存在一處17bp片斷的插入/缺失和一處A→G轉(zhuǎn)換，導(dǎo)致StuI位點(diǎn)出現(xiàn)A、B和C三種等位基因。在該位點(diǎn)，除純血馬以AB型和B為優(yōu)勢(shì)基因型和優(yōu)勢(shì)等位基因外，其它

5、類群馬的優(yōu)勢(shì)基因型和優(yōu)勢(shì)等位基因均為AA型和A，且巴爾虎馬、烏珠穆沁馬和烏審馬在此位點(diǎn)均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)：而存在于第1內(nèi)含子的T→C轉(zhuǎn)換和第2外顯子的G的插入/缺失，導(dǎo)致StyI位點(diǎn)出現(xiàn)D、E和F三種等位基因，且G的插入/缺失引起了移碼突變。該位點(diǎn)除純血馬的優(yōu)勢(shì)基因型和優(yōu)勢(shì)等位基因?yàn)镈D型和D外，其余類群馬均為EE型和E，且巴爾虎馬和烏審馬在此位點(diǎn)處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)。 8、不同類群馬

6、DRD4基因各位點(diǎn)純合度(Ho)、雜合度(He)、有效等位基因數(shù)(Ne)及多態(tài)信息含量(PIC)分析表明：StuI位點(diǎn)，純血馬、三河馬和巴爾虎馬為高度多態(tài)(P>0.5)，其余均為中度多態(tài)；StyI位點(diǎn)，烏審馬和烏珠穆沁馬為中度多態(tài)，其余均為高度多態(tài)。9、通過(guò)對(duì)不同類型馬第3外顯子的44條序列比對(duì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，共有40個(gè)核苷酸位點(diǎn)發(fā)生變異，有24種單倍型，26個(gè)單一多態(tài)位點(diǎn)，14個(gè)簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)；此位點(diǎn)的變異類型有轉(zhuǎn)換、顛換和VNTR三種，其中