盧氏雞IFN-γ成熟蛋白基因的克隆與原核表達(dá)產(chǎn)物處理方法研究.pdf

1、干擾素具有抗病毒、抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)等功能，可作為一種天然治療劑和佐劑，鑒于目前尚未見(jiàn)到關(guān)于地方優(yōu)良品種盧氏雞IFN-γ的相關(guān)研究報(bào)道，本文對(duì)盧氏雞IFN-γ成熟基因序列進(jìn)行了克隆、基因遺傳變異分析及原核表達(dá)，并通過(guò)超聲波破碎法、超聲波和溶菌酶聯(lián)合使用法、高壓勻漿法、高壓勻漿和溶菌酶聯(lián)合使用法等四種方法對(duì)盧氏雞IFN-γ重組蛋白進(jìn)行了提取，進(jìn)而對(duì)不同方法的提取效果進(jìn)行了研究，旨在為盧氏雞IFN-γ今后的開(kāi)發(fā)應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。試驗(yàn)的主要內(nèi)容

2、包括：
　　1.盧氏雞IFN-γ成熟基因序列克隆、鑒定及表達(dá)結(jié)果分析
　　應(yīng)用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增出盧氏雞IFN-γ的完整序列，利用在線生物學(xué)軟件預(yù)測(cè)其信號(hào)肽所在位置，從而設(shè)計(jì)盧氏雞IFN-γ成熟蛋白基因序列引物。
　　采用PCR技術(shù)進(jìn)行盧氏雞IFN-γ成熟蛋白基因序列的擴(kuò)增，并將其克隆到PET-28a載體上，獲得重組表達(dá)質(zhì)粒（PET28a-IFN-γ），并將其轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21中，通過(guò)酶切、PCR、測(cè)序、SDS-

3、PAGE進(jìn)行結(jié)果鑒定。結(jié)果顯示，雞IFN-γ成熟蛋白基因片段克隆成功，約438bp；并在大腸桿菌BL21中成功表達(dá)，約22KDa。
　　2.盧氏雞IFN-γ與其他禽類IFN-γ的同源性分析
　　將盧氏雞IFN-γ成熟基因與其它禽類的IFN-γ基因進(jìn)行了同源性分析，并繪制了系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果表明，盧氏雞IFN-γ與白萊航雞、印度原雞、原雞的核苷酸序列同源性均為99.5％，與火雞、雉雞、鵪鶉的核苷酸序列的同源性分別為96.6%、9

4、5.2%、95.0%，與吐綬雞的同源性為92.5%，與大雁、白色吐綬雞、青銅吐綬雞、珍珠雞的同源性均為70.8%，與野鴿的同源性為31.5%。
　　3.盧氏雞IFN-γ四種提取方法獲得的重組蛋白熱原質(zhì)、內(nèi)毒素的測(cè)定結(jié)果分析
　　通過(guò)動(dòng)物發(fā)熱試驗(yàn)結(jié)果可知，四種提取方法獲得的雞IFN-γ重組蛋白所含熱原的限度均符合規(guī)定，超聲波與溶菌酶聯(lián)合作用組與其它方法組相比，試驗(yàn)動(dòng)物的體溫變化最小，說(shuō)明該方法獲得的重組蛋白所含熱原質(zhì)的量最低。

5、
　　通過(guò)凝膠法對(duì)內(nèi)毒素含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示四種方法獲得的雞IFN-γ重組蛋白內(nèi)毒素含量均不超過(guò)規(guī)定限值（10EU/mL），符合國(guó)家相關(guān)規(guī)定。
　　4.雞IFN-γ四種提取方法獲得的重組蛋白對(duì)家禽生長(zhǎng)和免疫器官指數(shù)的影響
　　口服組和注射組中的五個(gè)試驗(yàn)組法氏囊指數(shù)、脾臟指數(shù)在免疫后0d~21d之間不存在顯著性差異；各試驗(yàn)組的胸腺指數(shù)的平均值在7~21d均高于對(duì)照組，并在21d時(shí)，超聲波與溶菌酶聯(lián)合作用組顯著高于對(duì)照組

6、，通過(guò)結(jié)果分析，可得知使雞IFN-γ對(duì)法氏囊、脾臟的生長(zhǎng)無(wú)影響，對(duì)胸腺的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用。
　　同時(shí)通過(guò)觀察試驗(yàn)動(dòng)物的生長(zhǎng)情況，口服組、注射組的試驗(yàn)動(dòng)物的精神狀態(tài)、飲食情況、糞便、剖檢、體重情況等與對(duì)照組沒(méi)有明顯的區(qū)別。
　　5.雞IFN-γ四種提取方法獲得的重組蛋白對(duì)NDVⅣ系弱毒苗抗體水平影響的測(cè)定結(jié)果分析
　　四種提取方法獲得的重組蛋白分別采取口服和注射方式和NDVⅥ系弱毒苗聯(lián)合使用，結(jié)果表明：口服組、注射組在免疫