肉牛肌生成抑制素成熟蛋白編碼序列的克隆與原核表達(dá).pdf

1、肌生成抑制素是轉(zhuǎn)化生長因子-β超家族中的一個成員，它是肌肉生長的負(fù)調(diào)控因子。通過基因打靶技術(shù)獲得的肌生成抑制素基因缺失鼠，其骨骼肌的數(shù)量呈現(xiàn)出明顯而廣泛的增加，而重量是正常小鼠的2-3倍；MSTN主要在成年動物的骨骼肌中表達(dá)，它的缺失及敲除可以使肉牛具有雙肌表型，這種牛的骨骼肌重量較一般品種大20％左右，而脂肪含量較低，肉質(zhì)性狀優(yōu)良。因此MSTN基因已成為目前畜禽肉質(zhì)性狀的最主要標(biāo)記基因。研究MSTN的結(jié)構(gòu)、構(gòu)建其原核表達(dá)載體和功能，目

2、的在于通過MSTN基因的抗體或抑制劑與MSTN基因結(jié)合，滅活其功能，安全高效地進(jìn)行組織細(xì)胞營養(yǎng)代謝調(diào)控。對于提高肉用動物產(chǎn)肉量和瘦肉率，改善肉的品質(zhì)，降低飼養(yǎng)成本等具有非常重要的理論意義和實(shí)際應(yīng)用價值。 本研究利用Trizol法，從肉牛的骨骼肌中提取總RNA。RT-PCR法擴(kuò)增出MSTNcDNA片段，并與pMD-18T載體相連接，轉(zhuǎn)化E.coliJM109。通過PCR、酶切鑒定及序列分析，篩選陽性克隆。 從MSTNmRN

3、A序列中設(shè)計引物上游5'端加BamHⅠ酶切位點(diǎn)和起始密碼子ATG，下游5'端加SalⅠ酶切位點(diǎn)和終止密碼子TTA，TCA。以MSTNcDNA為模板，PCR擴(kuò)增MSTN成熟蛋白編碼序列，用1％瓊脂糖電泳回收PCR產(chǎn)物。將PCR產(chǎn)物與pMD-18T載體16℃過夜連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入用TSS法制備的感受態(tài)細(xì)胞中，將轉(zhuǎn)化菌涂布在含有X-gal、IPTG和氨芐青霉素(Amp)的LB固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)12～16小時，挑選白色菌落培養(yǎng)，采用堿

4、裂解法提取質(zhì)粒，經(jīng)PCR和酶切鑒定，結(jié)果表明，以肉牛肌肉細(xì)胞總RNA為模板，擴(kuò)增出的MSTN基因的cDNA序列，產(chǎn)物全長1128bp，編碼375個氨基酸序列。成功地構(gòu)建了牛pMD18-T-MSTN克隆質(zhì)粒，測序分析結(jié)果與設(shè)計一致。 將克隆質(zhì)粒pMD-18T-MSTN與原核表達(dá)載體pET28a(+)同時用TaKaRa公司的回收試劑盒回收牛MSTN目的片段及pET28a(+)載體，在T4DNA連接酶、雙酶切的作用下將目的片段插入原核