牛IFNτ基因成熟蛋白CDS區(qū)的克隆、原核表達(dá)及其在妊娠建立過程中的生物學(xué)功能研究.pdf

1、牛干擾素τ(bIFN-τ)是由早期胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞產(chǎn)生，它能夠阻止子宮內(nèi)膜上溶黃體分子機(jī)制的發(fā)生，促進(jìn)黃體的發(fā)育，從而啟動(dòng)妊娠過程。大量的研究表明，bIFN-τ除了對(duì)妊娠識(shí)別過程起決定性的作用外，還在調(diào)節(jié)妊娠識(shí)別向胚胎植入轉(zhuǎn)變過程中，發(fā)揮重要作用。bIFN-τ是I型IFN家族成員，具有I型干擾素所共有的抗病毒、抗細(xì)胞增生、免疫調(diào)節(jié)等特性。與其他I型干擾素不同，IFN-τ僅在胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞中表達(dá)，無需病毒誘導(dǎo)；且IFN-τ的細(xì)胞毒性較其他I

2、型干擾素小?；贗FN-τ的上述功能和特性，當(dāng)前對(duì)IFN-τ的研究已逐漸成為熱點(diǎn)。 本研究以中國荷斯坦奶牛為試驗(yàn)材料，通過生物信息學(xué)分析，獲取牛IFN-τ成熟蛋白的CDS序列，以pMD18-T為載體，在E.coliJM109菌株中進(jìn)行IFN-τ成熟蛋白CDS區(qū)的分子克隆，并測(cè)其序列；以pET28a(+)作為表達(dá)載體，在E.coliBL21(DE3)工程菌株中進(jìn)行bIFN-τ組氨酸標(biāo)簽蛋白的融合表達(dá)。通過分子遺傳進(jìn)化分析方法，分析

3、了不同亞型bIFN-τ、不同物種IFN-τ和牛IFN家族的同源性、遺傳距離和分子進(jìn)化關(guān)系；運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)分析工具，對(duì)表達(dá)產(chǎn)物的基本性質(zhì)、糖基化位點(diǎn)、磷酸化位點(diǎn)、激酶作用位點(diǎn)、疏水性、二硫鍵位置、二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)和保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)，初步分析了bIFN-τ表達(dá)產(chǎn)物與bIFN-τ成熟蛋白的差異。采用蛋白質(zhì)親和層析技術(shù)，對(duì)bIFN-τ表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化。建立了一套完整的bIFN-τ表達(dá)產(chǎn)物純化方法。最后以牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞作為研究模型，模擬在體水

4、平的激素濃度，研究了bIFN-τ、孕酮、孕酮結(jié)合bIFN-τ作用下，對(duì)牛子宮內(nèi)膜上妊娠識(shí)別和胚胎植入相關(guān)基因表達(dá)的影響。主要研究結(jié)果如下： 從來自不同個(gè)體的4個(gè)克隆中鑒別出2條不同的DNA序列。測(cè)序結(jié)果表明，中國荷斯坦奶牛bIFN-τ成熟蛋白的完整CDS序列為519bp，為含單一外顯子的完整ORF區(qū)，此ORF編碼含有172個(gè)氨基酸的bIFN-τ成熟蛋白.將這2條DNA序列提交到GenBank，獲得登錄號(hào)為DQ680846和DQ6

5、80847。各亞型bIFN-τ基因核苷酸序列間的同源性在93.1％～99.8％之間，推導(dǎo)氨基酸序列間的同源性在87.9％～98.8％之間；不同物種之間IFN-τ基因核苷酸序列間的同源性在84.2％～99.2％之間，推導(dǎo)氨基酸序列間的同源性在67.1％～97.1％之間。結(jié)果表明該基因同源性很高，充分說明該基因在進(jìn)化過程中相當(dāng)保守。 聚類分析表明：可將bIFN-τ聚為3類，其中DQ680846聚在τ4類(τ4a)，DQ680847聚

6、在τ3類(τ3f)；不同物種的聚類分析表明，bIFNτ3f,.bIFNτ-4a聚入一枝，而且在系統(tǒng)發(fā)育上與美洲野牛的關(guān)系較近。bIFN聚類分析同樣支持bIFN-τ4a、blFN-τ3f為I型干擾素，在I類干擾素家族中：bIFN-τ的關(guān)系與bIFN-δ、ω較近，與IFN-α、β較遠(yuǎn)。 重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-bIFN-τ經(jīng)測(cè)序證實(shí)，目的基因插入方向和讀碼框正確。通過蛋白質(zhì)組學(xué)分析工具表明，blFN-τ表達(dá)產(chǎn)物與bIFN-τ成熟

7、蛋白相比，糖基化位點(diǎn)、二硫鍵位置、三級(jí)結(jié)構(gòu)、保守結(jié)構(gòu)域均無差異；表達(dá)產(chǎn)物的親水能力增強(qiáng)、等電點(diǎn)升高、半衰期延長、穩(wěn)定性增加；激酶潛在作用位點(diǎn)之間的差異很小；表達(dá)產(chǎn)物在N-19位增加了一個(gè)Ser磷酸化位點(diǎn)，N-端增加了組氨酸標(biāo)簽的無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)。用1.0mmol/LIPTG誘導(dǎo)，以37℃，誘導(dǎo)4h的優(yōu)化條件培養(yǎng)大腸桿菌后，融合蛋白的表達(dá)量提高到占菌體總蛋白的28.84％。 誘導(dǎo)表達(dá)的大腸桿菌經(jīng)洗滌、超聲波破碎、離心獲得包涵體。純化后

8、包涵體的產(chǎn)量達(dá)到2.6983±0.1967g/L。包涵體用8M脲變性緩沖液溶解后，用HisTrapHP親和層析柱純化表達(dá)產(chǎn)物。咪唑和pH值洗脫結(jié)果表明：咪唑洗脫優(yōu)于pH洗脫(P<0.05)，用400mM的咪唑洗脫顯著優(yōu)于其他洗脫條件(P<0.05)，在該條件下bIFN-τ表達(dá)產(chǎn)物的得率最高，占上柱總蛋白的26.36％。柱上復(fù)性研究表明：1.5M脲的洗脫緩沖液能夠獲得bIFN-τ表達(dá)產(chǎn)物。洗脫產(chǎn)物用HisTrapDesalting脫鹽后，

9、bIFN-τ表達(dá)產(chǎn)物溶液的電導(dǎo)性從50mS/cm降低到4mS/cm。將純化后的bIFN-τ表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行等電聚焦測(cè)定等電點(diǎn)和用IBA裂解獲得肽指紋圖譜進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明親和層析獲得了高純度的bIFN-τ表達(dá)產(chǎn)物。 子宮內(nèi)膜細(xì)胞體外培養(yǎng)表明：在0.2nME2+100IU/mLPen.+100μg/mLStr+2μunol/mLGlu+DMEM-Ham'sF12的帶血清和無血清培養(yǎng)體系中，牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞均能正常生長。原代和傳代細(xì)胞類型

10、主要為來自子宮內(nèi)膜上皮的上皮細(xì)胞和來自子宮內(nèi)膜基質(zhì)的成纖維細(xì)胞。 通過熒光定量PCR分析孕酮、bIFN-τ對(duì)牛子宮內(nèi)膜上妊娠識(shí)別和胚胎植入相關(guān)基因表達(dá)的研究結(jié)果表明：孕酮能夠顯著地抑制牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞上ER-α、COX-2、TIMP-2基因的表達(dá)和顯著地促進(jìn)ER-β、MMP-2基因的表達(dá)(P<0.05)，能夠促進(jìn)和穩(wěn)定PGR的表達(dá)，對(duì)OXTR、PGRMC1和UCRP的表達(dá)無影響。bIFN-τ能夠顯著地抑制牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞上ER-α、

11、ER-β、OXT-R、TIMP-2基因的表達(dá)和顯著地促進(jìn)COX-2、PTGES、PGR、UCRP基因的表達(dá)(P<0.05)，對(duì)MMP-2的表達(dá)具有穩(wěn)定作用.在孕酮和bIFN-τ的協(xié)同作用下，能夠促進(jìn)牛子宮內(nèi)膜上PGRMC1基因的表達(dá)。 孕酮和bIFN-τ處理不同時(shí)間對(duì)基因表達(dá)水平的分析表明：孕酮對(duì)基因表達(dá)發(fā)生調(diào)控作用較慢，bIFN-τ對(duì)基因表達(dá)發(fā)生調(diào)控作用的時(shí)間相對(duì)較快；在10個(gè)基因中，對(duì)調(diào)控信號(hào)能夠迅速作出反應(yīng)的基因有PGRM