血瘀證（心肌缺血）動(dòng)物模型及其相關(guān)蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、血瘀證(心肌缺血)動(dòng)物模型及其相關(guān)蛋白質(zhì)組學(xué)的研究證候是中醫(yī)藥理論的核心內(nèi)容，證候科學(xué)內(nèi)涵的揭示是中醫(yī)基礎(chǔ)理論現(xiàn)代化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，而證候生物學(xué)基礎(chǔ)研究的突破則是證候科學(xué)內(nèi)涵得以闡明的保障。證候生物學(xué)基礎(chǔ)的研究同樣需要借助動(dòng)物模型這個(gè)必須的工具。目前，證候動(dòng)物模型的建立和評(píng)價(jià)存在巨大的爭(zhēng)議，缺乏公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)，亟待尋找可行的途徑。通過(guò)在疾病模型的基礎(chǔ)上，對(duì)模型動(dòng)物進(jìn)行動(dòng)態(tài)的觀察、評(píng)價(jià)以確定其證候?qū)傩缘姆椒?，有可能建立符合中醫(yī)理論且穩(wěn)定性較好的病

2、證結(jié)合動(dòng)物模型。 同時(shí)，以往證候的生物學(xué)基礎(chǔ)研究多致力于尋找可用于證候診斷的金指標(biāo)，但由于忽略了證候的整體性而遇到了瓶頸。系統(tǒng)生物學(xué)研究技術(shù)和方法的興起和發(fā)展，為證候生物學(xué)基礎(chǔ)的研究帶來(lái)了新的契機(jī)。循環(huán)系統(tǒng)作為機(jī)體各種組織、器官、細(xì)胞聯(lián)系的紐帶，在機(jī)體的生命活動(dòng)過(guò)程中起著重要的作用，更能反映機(jī)體整體的生理病理狀態(tài)。因此，對(duì)于證候相關(guān)的血漿蛋白質(zhì)組學(xué)的研究有可能發(fā)現(xiàn)證候在蛋白質(zhì)層面的特征模式。 血瘀證的是冠心病的最常見(jiàn)的證

3、型，同時(shí)有著較好的研究基礎(chǔ)，因此血瘀證的研究可作為證候動(dòng)物模型研究的切入點(diǎn)，即通過(guò)對(duì)心肌缺血模型動(dòng)態(tài)觀察確定血瘀證時(shí)間窗的方式來(lái)建立血瘀證(心肌缺血)動(dòng)物模型，并對(duì)血瘀證(心肌缺血)動(dòng)物血漿蛋白質(zhì)組學(xué)進(jìn)行研究，以探討將蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)應(yīng)用于證候生物學(xué)基礎(chǔ)研究的可行性。 目的： 建立穩(wěn)定的血瘀證(心肌缺血)動(dòng)物模型，并尋找其相關(guān)的血漿蛋白質(zhì)組學(xué)特征。 方法： 1 小型豬血瘀證(心肌缺血)模型的建立和評(píng)價(jià)

4、 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)育種健康中華小型豬，體重25±4kg，月齡6—10個(gè)月，雌雄不限，隨機(jī)分為模型組和假手術(shù)組。模型組動(dòng)物在麻醉、無(wú)菌條件下開(kāi)胸，分離前降支，在第一對(duì)角支遠(yuǎn)端的前降支主干放置Ameroid縮窄環(huán)，關(guān)胸。假手術(shù)組除不放置縮窄環(huán)外，其余均同模型組。 1.1 參考前期動(dòng)態(tài)觀察的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在術(shù)后4周采集動(dòng)物四診信息，進(jìn)行心電圖、超聲心動(dòng)、冠脈造影等檢查，并在前腔靜脈采血，檢測(cè)血液流變學(xué)指標(biāo)以及前列環(huán)素(PGl<,2>)、血栓

5、素A2(TXA<,2>)、內(nèi)皮素(ET-1)、降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)等血管活性物質(zhì)的含量。參考上述指征，對(duì)模型動(dòng)物的疾病類(lèi)型及證候?qū)傩赃M(jìn)行診斷。 1.2 診斷為心肌缺血血瘀證的模型動(dòng)物隨機(jī)分為活血化瘀組及模型組，每組6只?；钛鼋M動(dòng)物每同喂飼丹七片9g/只，用藥4周，飲食及飼養(yǎng)條件同模型組及假手術(shù)。 實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)采集動(dòng)物四診信息，進(jìn)行心電圖、超聲心動(dòng)、冠脈造影等檢查，并在前腔靜脈采血，檢測(cè)血液流變學(xué)指標(biāo)以及PGl<,

6、2>、TXA<,2>、ET-1、CGRP等血管活性物質(zhì)的含量，根據(jù)上述信息再次對(duì)模型動(dòng)物的疾病及證候進(jìn)行診斷，以確定模型動(dòng)物表現(xiàn)為心肌缺血血瘀證的時(shí)間窗。在實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)對(duì)心肌組織采用常規(guī)石蠟包埋，HE、Masson染色觀察其形態(tài)學(xué)變化。觀察丹七片對(duì)對(duì)上述指標(biāo)的影響，評(píng)價(jià)其對(duì)心肌缺血以及血瘀證的改善作用，以增加證候診斷的證據(jù)。 2 小型豬血瘀證(心肌缺血)的血漿差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究術(shù)后4周，前腔靜脈采血，枸櫞酸鈉抗凝，離心收集上清備用。

7、血漿總蛋白采用Bradford法測(cè)定，加樣1.3mg。PH范圍3-11NL 24cmIPG膠條等電聚焦，1mm、13％SDS-PAGE二相分離?？捡R斯亮藍(lán)R350染色，凝膠掃描后，采用Imagemaster 2D Platinum6.0軟件進(jìn)行凝膠的蛋白點(diǎn)檢測(cè)、匹配。對(duì)匹配蛋白點(diǎn)的體積百分比進(jìn)行比較，確定差異蛋白點(diǎn)。差異蛋白點(diǎn)胰蛋白酶酶切后，MAILDI-TOF檢測(cè)，數(shù)據(jù)庫(kù)搜索，確定其相關(guān)信息。 術(shù)后8周，分別采集模型組、假手術(shù)

8、組、活血化瘀組動(dòng)物血漿樣本，并進(jìn)行雙向凝膠電泳分析及蛋白點(diǎn)的檢測(cè)、匹配，方法同前。通過(guò)與手術(shù)4周時(shí)凝膠的匹配，觀察術(shù)后4周存在的差異蛋白點(diǎn)在8周模型中的變化以及活血化瘀藥物對(duì)這些蛋白的影響。 結(jié)果： 1 小型豬血瘀證(心肌缺血)模型的建立和評(píng)價(jià) 1.1 術(shù)后4周模型評(píng)價(jià) 1.1.1 四診信息：模型動(dòng)物出現(xiàn)精神緊張、易激惹，怕人，不易接近，沖撞籠欄；被毛雜亂、無(wú)光澤等表現(xiàn)，舌色略見(jiàn)暗紅或青紫；假手術(shù)動(dòng)物精神

9、逐漸恢復(fù)正常，進(jìn)食、飲水量增加，被毛整齊，有光澤，舌色淡紅或淡白。 1.1.2 心電圖：模型組動(dòng)物多在V3、V4導(dǎo)聯(lián)出現(xiàn)ST段水平或斜行向下壓低達(dá)O．1mV，同時(shí)出現(xiàn)多導(dǎo)聯(lián)的T波倒置；部分動(dòng)物出現(xiàn)異常Q波。在觀察期間模型動(dòng)物未發(fā)現(xiàn)明顯的心律失常。 1.1.3 超聲心動(dòng)圖：與假手術(shù)組相比，模型動(dòng)物心臟超聲的特征主要表現(xiàn)為左室腔結(jié)構(gòu)的變化，即左室舒張末、收縮末內(nèi)徑(P<0.01)及容積(P<0.05)的擴(kuò)大。左室前壁乳頭肌及

10、心尖平面收縮末及舒張末厚度的減小，以收縮末的變化更為顯著(P<0.01)。同時(shí)，心尖水平的左室前壁收縮期室壁增厚率減小(P<0.01)。另外，室間隔收縮木厚度減小(P<0.05)。心臟整體的功能包括SV、EF、FS以及E/A比等均無(wú)明顯變化，提示其心功能仍處于代償期。 1.1.4 冠脈造影：模型動(dòng)物前降支狹窄率在90％以上，甚至完全閉塞，TIMI血流分級(jí)多為Ⅰ級(jí)和Ⅱ級(jí)。假手術(shù)組前降支充盈良好，TIMI血流Ⅲ級(jí)。 1.1.

11、5 血液流變學(xué)：與假手術(shù)組相比，模型動(dòng)物的血液流變學(xué)特征主要表現(xiàn)為高(P<0.05)、中(P<0.01)、低(P<0.01)切變率下全血黏度的升高，而其紅細(xì)胞的聚集以及變形指數(shù)等無(wú)明顯差異。 1.1.6其它血液理化指標(biāo)：與假手術(shù)組相比，模型組動(dòng)物的血漿6-K-PGF<,1>。顯著降低(P<0.05)，TXBe、K/T無(wú)顯著差異；血漿CGRP、ET、E/C均無(wú)明顯變化。 1.2 術(shù)后8周模型評(píng)價(jià) 1.2.1 術(shù)后第

12、8周，模型動(dòng)物精神狀況有所恢復(fù)，飲食、二便接近正常；被毛雜亂、無(wú)光澤等表現(xiàn)仍然存在，舌象仍表現(xiàn)為舌色略見(jiàn)暗紅或青紫，無(wú)明顯的瘀點(diǎn)瘀斑。 1.2.2 心電圖：模型組動(dòng)物心電圖與術(shù)后4周相近。 1.2.3 超聲心動(dòng)圖：模型組與假手術(shù)組相比，與術(shù)后4周存在相似的差異。 1.2.4 血液流變學(xué)：模型組動(dòng)物高、中、低切變率下的全血黏度較假手術(shù)組顯著增高(P<0.01)，紅細(xì)胞壓積較假手術(shù)組顯著升高(P<0.05)。

13、 1.2.5 其它血液理化指標(biāo)：術(shù)后8周，模型組動(dòng)物血漿6-K-PGF<,1>。水平較假手術(shù)組顯著降低(P<0.05、)。 1.3 活血化瘀藥物丹七片的治療作用1.3.1 活血化瘀組動(dòng)物四診信息、心電圖與模型組相比無(wú)顯著差異。 1.3.2超聲心動(dòng)圖：模型組室間隔收縮末厚度較假手術(shù)組顯著減小(P<0.05)，而活血化瘀組與假手術(shù)組相比無(wú)顯著差異。 1.3.3 血液流變學(xué)：與模型組相比，活血化瘀組紅細(xì)胞壓積測(cè)定值顯著

14、回落(P<0.05)，且與假手術(shù)組相比無(wú)顯著差異；活血化瘀組紅細(xì)胞變形指數(shù)較模型組顯著增加(P<0.05)。 1.3.4 其它理化指標(biāo)：與模型組相比，活血化瘀組動(dòng)物血漿6-K-PGF<,1>。顯著回升(P<0.05)，與假手術(shù)組無(wú)顯著差異。 1.3.5病理學(xué)觀察：HE染色見(jiàn)假手術(shù)組動(dòng)物心肌排列整齊、結(jié)構(gòu)清晰；模型動(dòng)物病變區(qū)表現(xiàn)為心肌細(xì)胞排列紊亂，心肌細(xì)胞腫脹、變性、壞死，炎細(xì)胞侵潤(rùn)；活血化瘀組動(dòng)物有明顯的改善。Masso

15、n染色見(jiàn)模型組動(dòng)物病變區(qū)心肌間質(zhì)膠原組織增多，心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂，細(xì)胞核或細(xì)胞漿空泡變性，破壞的心肌被膠原組織取代，同時(shí)可見(jiàn)炎細(xì)胞浸潤(rùn)；活血化瘀組動(dòng)物心肌膠原沉積區(qū)數(shù)量和面積均小于模型組。 2 小型豬心肌缺血血瘀證的血漿差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究 在術(shù)后4周混合樣品的電泳發(fā)現(xiàn)模型組有10個(gè)明顯的上調(diào)蛋白點(diǎn)；在單一血漿樣品的電泳發(fā)現(xiàn)9個(gè)明顯的上調(diào)蛋白點(diǎn)。其中1個(gè)蛋白點(diǎn)在兩次實(shí)驗(yàn)中均有差異。 質(zhì)譜鑒定結(jié)果提示，部分上調(diào)的差異蛋

16、白為a1-酸性糖蛋白、a1-抗胰蛋白酶、胎球蛋白A、載脂蛋白A-I、載脂蛋白A-IV、補(bǔ)體C4、補(bǔ)體細(xì)胞溶解抑制因子。 模型組在術(shù)后4周存在的部分差異蛋白點(diǎn)在術(shù)后8周仍有差異，但其相對(duì)含量與術(shù)后4周不同。而活血化瘀藥物只對(duì)上述部分差異蛋白有影響。 結(jié)論： 1 模型動(dòng)物在術(shù)后4周，可診斷為心肌缺血血瘀證，且該診斷在術(shù)后8周仍成立。提示在該時(shí)間窗，此類(lèi)動(dòng)物模型穩(wěn)定表現(xiàn)為血瘀證(心肌缺血)。丹七片可以改善心肌缺血及血瘀

17、證的部分表現(xiàn)，在一定程度上佐證了上述診斷。 2 模型組與假手術(shù)組相比，已鑒定的差異蛋白質(zhì)主要為急性期反應(yīng)蛋白、補(bǔ)體系統(tǒng)以及載脂蛋白等，炎癥/抗炎是其互相聯(lián)系的核心環(huán)節(jié)，提示在該心肌缺血血瘀證同時(shí)存在著炎癥反應(yīng)這一病理進(jìn)程，炎癥反應(yīng)可能是血瘀證的病理機(jī)制之一，但仍有待進(jìn)一步研究。 這些蛋白在術(shù)后8周則表現(xiàn)為這些蛋白不同的組合模式，但仍維持了其基本特征。提示證候的蛋白質(zhì)組學(xué)特征可能是某些差異蛋白及其組合模式。 丹七片