Reg Ⅳ和miR-24在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用及機(jī)制.pdf

1、目的：研究Reg IV基因在胃癌中的表達(dá)情況及其與臨床病理特征之間的相關(guān)性；探索Reg IV基因在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用及可能的調(diào)控機(jī)制。 方法：運(yùn)用實(shí)時(shí)定量PCR的方法檢測了48例胃癌病人腫瘤組織及相配對的正常胃粘膜組織中的Reg IV的表達(dá)情況，并與臨床病理特征相聯(lián)系，了解其相關(guān)性；運(yùn)用免疫組化的方法檢測了18例胃癌病人腫瘤組織及相配對的正常胃粘膜組織中的Reg IV蛋白的表達(dá)定位情況。同時(shí)，實(shí)時(shí)定量PCR的方法比較胃癌細(xì)胞株

2、與永生化胃粘膜細(xì)胞株之間Reg IV的表達(dá)差異，挑選Reg IV高表達(dá)細(xì)胞株，運(yùn)用RNAi的方法下調(diào)Reg IV的表達(dá)，觀察Reg IV表達(dá)下調(diào)后胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為的改變，包括細(xì)胞增殖能力、凋亡情況以及遷移侵襲能力等。利用互聯(lián)網(wǎng)microRNA數(shù)據(jù)庫預(yù)測發(fā)現(xiàn)miR-24調(diào)控Reg IV的表達(dá)，檢測胃癌組織及胃癌細(xì)胞株中miR-24的表達(dá)情況，分析miR-24和Reg IV在胃癌組織中的表達(dá)相關(guān)性；將miR-24和miR-24反義寡核苷酸

3、分別轉(zhuǎn)染SNU-16和BGC-823胃癌細(xì)胞株，通過實(shí)時(shí)定量PCR 以及ELISA檢測轉(zhuǎn)染后Reg IV的表達(dá)情況的變化，同時(shí)檢測了轉(zhuǎn)染后胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為的變化。 結(jié)果：實(shí)時(shí)定量PCR檢測結(jié)果顯示在48例胃癌病人腫瘤組織中有28（58.3％）例Reg IV基因高表達(dá)，RegIV的表達(dá)與胃癌的分化程度、組織分型、侵潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期等臨床病理因素?zé)o相關(guān)性。免疫組化檢測結(jié)果顯示Reg IV在正常胃粘膜中表達(dá)陰性，在腸化

4、生的胃粘膜組織中表達(dá)呈弱陽性，而在胃印戒細(xì)胞癌中表達(dá)呈強(qiáng)陽性。與永生化胃黏膜細(xì)胞株GES-1相比，除了MKN-45和SNU-1以外，各胃癌細(xì)胞株中Reg IV的表達(dá)水平均升高5倍以上，特別是SNU-16細(xì)胞，RegIV的表達(dá)水平比GES-1升高7120.333倍，遂用SNU-16細(xì)胞株做RNAi 以及體外功能實(shí)驗(yàn)。用針對Reg IV的siRNA1進(jìn)行RNAi實(shí)驗(yàn)，24h后SNU-16細(xì)胞在mRNA水平RegIV的抑制效率為79.3％，4

5、8小時(shí)后用ELISA檢測轉(zhuǎn)染后的SNU-16細(xì)胞培養(yǎng)液上清發(fā)現(xiàn)在蛋白水平同樣觀察到Reg IV表達(dá)受到抑制。Reg IV表達(dá)受到抑制后SNU-16細(xì)胞的增殖能力、遷移及侵襲能力明顯降低，而細(xì)胞凋亡率增加。實(shí)時(shí)定量PCR檢測37例胃癌病人腫瘤組織中miR-24的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)有17例（45.9％）低表達(dá)，miR-24表達(dá)情況與胃癌的浸潤深度有關(guān)，與分化程度、組織分型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM 分期等臨床病理特征無關(guān)。在9 株胃癌細(xì)胞株中SNU-16

6、的miR-24的表達(dá)量最低，BGC-823的表達(dá)量最高，于是選用這兩株細(xì)胞株進(jìn)行后續(xù)的miR-24的上調(diào)和下調(diào)實(shí)驗(yàn)。將miR-24以及miR-24反義寡核苷酸分別轉(zhuǎn)染SNU-16和BGC-823細(xì)胞株中，24h后Reg IV mRNA水平變化不明顯；而48小時(shí)后ELISA檢測發(fā)現(xiàn)，與陰性對照組相比，SNU-16細(xì)胞培養(yǎng)液上清中Reg IV蛋白水平明顯降低，而BGC-823細(xì)胞上清中Reg IV蛋白水平明顯升高，表明miR-24 對Reg

7、 IV基因的翻譯具有調(diào)控作用。體外功能學(xué)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)SNU-16細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-24 后，細(xì)胞的增殖能力、遷移及侵襲能力明顯降低，而細(xì)胞凋亡率增加；而BGC-823細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-24反義寡核苷酸后，細(xì)胞的增殖能力、遷移及侵襲能力明顯增強(qiáng)，而細(xì)胞凋亡率則顯著下降。 結(jié)論：①Reg IV在胃癌組織中表達(dá)上調(diào)，但與胃癌的分化程度、組織分型、侵潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM 分期等臨床病理因素?zé)o關(guān)；②Reg IV基因在胃癌中起到了促增殖、抗凋