重組人白細(xì)胞介素10基因慢病毒載體的構(gòu)建及其鎮(zhèn)痛效應(yīng)的研究.pdf

1、神經(jīng)病理性疼痛是一種難治性的慢性疼痛綜合癥，盡管藥物治療神經(jīng)病理性疼痛有數(shù)十年的歷史，但療效一直欠佳。最近一些研究認(rèn)為脊髓神經(jīng)膠質(zhì)及其釋放的致炎性細(xì)胞因子與神經(jīng)病理性疼痛密切相關(guān)，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的活性及其下游的信號(hào)分子可能成為治療神經(jīng)病理性疼痛的重要靶點(diǎn)。白細(xì)胞介素10(Interleukin-10，IL-10)是重要的抗炎細(xì)胞因子，能抑制多種細(xì)胞合成與釋放促炎細(xì)胞因子，有研究證明IL-10對(duì)脊髓損傷、慢性坐骨神經(jīng)壓迫性損傷、鞘內(nèi)注射gp

2、120(HIV1的包膜蛋白)等原因?qū)е碌拇笫笊窠?jīng)病理性疼痛有顯著治療效果。研究證明將鎮(zhèn)痛相關(guān)基因?qū)胫袠猩窠?jīng)系統(tǒng)能取得較好的鎮(zhèn)痛作用，復(fù)制缺陷的病毒載體理論上具有高效、安全和穩(wěn)定的特點(diǎn)，具有良好的應(yīng)用前景。以HIV1來(lái)源的慢病毒載體作為一種特殊的逆轉(zhuǎn)錄病毒，其最大特點(diǎn)是轉(zhuǎn)染效率高、易整合、不僅感染分裂期細(xì)胞，還可感染非分裂期細(xì)胞，并可以在體內(nèi)較長(zhǎng)期的表達(dá)，且安全性較好。因此，本研究擬構(gòu)建含人白細(xì)胞介素10基因(human Interle

3、ukin-10，hIL-10)的重組慢病毒載體(Lentivector，LV)，觀察其離體和在體感染后IL-10的過(guò)表達(dá)及對(duì)慢性神經(jīng)病理性疼痛的鎮(zhèn)痛效應(yīng)。 目的 構(gòu)建含人白細(xì)胞介素10基因的重組慢病毒載體LV/hIL-10，觀察LV/hIL-10對(duì)激活的星形膠質(zhì)細(xì)胞的干預(yù)作用及其對(duì)慢性疼痛模型大鼠(chronic constriction injury，CCI)的鎮(zhèn)痛效應(yīng)，初步探討HMGB1是否參與了CCI大鼠的痛敏維持

4、。 方法 1．合成引物，以pCYIL-10質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增出hIL-10基因，并重組到質(zhì)粒pWPXL-GFP，酶切、測(cè)序鑒定正確后，將重組質(zhì)粒pWPXL-hIL-10與包膜質(zhì)粒pMD2.G、包裝質(zhì)粒psPAX2共轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞，包裝出復(fù)制缺陷的慢病毒顆粒，進(jìn)行病毒滴度的測(cè)定。 2．將DI TNC1(大鼠大腦皮質(zhì)組織來(lái)源的星形膠質(zhì)細(xì)胞株)細(xì)胞培養(yǎng)分瓶后，用不同濃度(0、250、500、750、1000ng

5、/mL)大腸桿菌的LPS作用于DI TNC1 8h后，ELISA測(cè)定促炎因子TNF-α、IL-1β的分泌。500ng/ml LPS作用于DI TNCl不同時(shí)間后，PT-PCR測(cè)定TNF-α、IL-1β和晚期炎癥介質(zhì)高遷移率族蛋白-1(High MobilityGroup Boxl，HMGB1)的mRNA表達(dá)，ELISA測(cè)定TNF-α、IL-1β的分泌，Western Blot測(cè)定HMGB1的蛋白表達(dá)。LV/hIL-10、LV-GFP瞬時(shí)

6、轉(zhuǎn)染DI TNC1，4h后檢測(cè)IL-10的mRNA表達(dá)和蛋白分泌，LV/hIL-10、LV-GFP轉(zhuǎn)染LPS所致DI TNC1細(xì)胞后，分別測(cè)定各時(shí)點(diǎn)TNF-α、IL-1β和HMGB1 mRNA的表達(dá)及其分泌。 3．純種健康清潔級(jí)成年雄性SD大鼠135只，隨機(jī)分為9組：CCI疼痛模型4組(C0、C1、C2、C3)，假手術(shù)4組(S0、S1、S2、S3)和正常對(duì)照組(N組)。分別給予蛛網(wǎng)膜下腔注射LV/hIL-10(C1組、S1組)、

7、LV-GFP(C2組、S2組)、生理鹽水(C3組、S3組)，C0組、S0組為對(duì)照組(不做鞘內(nèi)置管，不給藥)。觀察各組術(shù)后3d、7d、14d、21d、28d的疼痛行為學(xué)的改變及3d、7d、14d脊髓、腦皮質(zhì)、海馬中的IL-10、IL-1β、TNF-α、ftMGB1的mRNA和蛋白表達(dá)。C0組、S0組及NN笫7d測(cè)試痛閾后各取3只深麻醉下灌注取材，免疫組織化學(xué)法檢測(cè)大鼠腦皮質(zhì)、海馬、脊髓組織GFAP、NF-kB的表達(dá)。 結(jié)果

8、 1．從pCYIL-10質(zhì)粒中擴(kuò)增得到含PmeI多功能酶切位點(diǎn)的hIL-10基因片段，hIL-10基因重組到pWPXL-GFP載體，酶切鑒定的電泳結(jié)果顯示，pWPXL-hIL-10質(zhì)粒含有530bp左右的插入基因片斷，測(cè)序結(jié)果顯示pWPXL-hIL-10質(zhì)粒上插入片段的序列與人IL-10基因序列完全一致。并獲得了高滴度(2x10<'10>)的重組慢病毒LV/hIL-10。 2．不同濃度的12S誘導(dǎo)DI FNC1細(xì)胞8h后，TNF

9、-α、IL-1β的分泌以LPS濃度為500ng/ml最為明顯，500ng/ml LPS誘導(dǎo)DI TNC1后TNF-α、IL-1β mRNA的表達(dá)2h上調(diào)最顯著。HMGB1的mRNA表達(dá)12h最顯著，蛋白表達(dá)在18h達(dá)高峰，24h仍維持較高的水平。培養(yǎng)基上清中HMGBl蛋白的分泌18h最多。LV/hIL-10感染DI TNC1細(xì)胞4h后，IL-10表達(dá)明顯上調(diào)，LV/hIL-10感染LPS所致DI TNC1細(xì)胞后，明顯抑制TNF-α、IL

10、-1β和HMGB1 mRNA的表達(dá)及其蛋白分泌。 3．CCI模型大鼠術(shù)后3d出現(xiàn)痛覺(jué)異常現(xiàn)象，7d最明顯，術(shù)后第7d觀察到大鼠的對(duì)側(cè)后爪有明顯的觸痛異常(鏡像疼痛)。CCI大鼠腦皮質(zhì)、海馬、脊髓組織中GFAP、NF-kB的表達(dá)在7d時(shí)呈強(qiáng)陽(yáng)性，腰段脊髓TNF-α、IL-1β、IL-10在術(shù)后3d、7d表達(dá)最明顯，14d時(shí)基本不表達(dá)。HMGB1 7d時(shí)表達(dá)增強(qiáng)，14d時(shí)維持較高的水平。在脊髓、腦皮質(zhì)、海馬三種組織中，本實(shí)驗(yàn)所測(cè)各指

11、標(biāo)以脊髓中的表達(dá)最顯著。CCI組鞘內(nèi)注射LV/hIL-10 3d后痛覺(jué)異常明顯緩解，同時(shí)檢測(cè)脊髓中的IL-10表達(dá)上調(diào)明顯，而TNF-α、IL-1β的表達(dá)明顯下調(diào)，術(shù)后14d脊髓的HMGB1表達(dá)明顯下調(diào)。 結(jié)論 1．成功構(gòu)建了含人白細(xì)胞介素10基因的慢病毒載體：LV/hIL-10 2．LPS激活星形膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生免疫細(xì)胞樣作用，分泌TNF-α、IL-1β和HMGB1(HMGB1分泌出現(xiàn)較晚且維持的時(shí)間較長(zhǎng))，LV/