重組人前腦啡肽原基因腺相關(guān)病毒載體的構(gòu)建及其鎮(zhèn)痛效應(yīng)的研究.pdf

1、研究背景及目的：近來研究證明，將鎮(zhèn)痛相關(guān)基因?qū)胫袠猩窠?jīng)系統(tǒng)能取得較好的鎮(zhèn)痛作用，這為晚期癌癥患者和慢性疼痛患者帶來了希望。重組腺相關(guān)病毒是目前認(rèn)為最安全的病毒載體，在許多疾病的治療中都得到應(yīng)用。但在疼痛治療領(lǐng)域研究較少。本研究擬構(gòu)建含人前腦啡肽原基因(humanpreproenkephalin，hPPE)的重組腺相關(guān)病毒2型(recombinantadenoassociatedvirustype2，rAAV2)載體rAAV2/hPPE

2、。觀察其對(duì)不同神經(jīng)細(xì)胞的感染特性及轉(zhuǎn)染此病毒后hPPE基因的表達(dá)。將此病毒載體注射到慢性疼痛模型大鼠體內(nèi)，觀察rAAV2介導(dǎo)的hPPE體內(nèi)轉(zhuǎn)染的鎮(zhèn)痛作用。 方法： 1.重組人前腦啡肽原基因腺相關(guān)病毒載體的構(gòu)建：從pCMV-hPPE質(zhì)粒上克隆hPPE基因，構(gòu)建到質(zhì)粒骨架上含有新霉素抗性基因表達(dá)盒的質(zhì)粒pSNAV上得到重組,pSNAV-hPPE，將此重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BHK21細(xì)胞后，用G418篩選培養(yǎng)形成穩(wěn)定攜帶rAAV2載體的

3、混合細(xì)胞株BHK-SH1；再用HSV1-rc/△UL2感染、包裝此細(xì)胞株并收獲病毒rAAV2/hPPE。用SDS-PAGE電泳測(cè)定蛋白質(zhì)純度，用Southernblot測(cè)定病毒滴度。 2.用陽性對(duì)照病毒rAAV2/eGFP分別感染體外培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元和神經(jīng)干細(xì)胞，觀察rAAV2對(duì)這三種細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率，用5％血清誘導(dǎo)轉(zhuǎn)染后的神經(jīng)干細(xì)胞，觀察rAAV2感染對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞的分化、傳代的影響；用rAAV2/hPPE感染上述三種細(xì)胞

4、，RT-PCR方法檢測(cè)細(xì)胞感染后目的基因hPPE的表達(dá)，用放射免疫方法測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)液中L-EK的含量。 3.將陽性對(duì)照質(zhì)粒rAAV2/eGFP分別經(jīng)蛛網(wǎng)膜下、尾靜脈和骨骼肌注射到大鼠體內(nèi)，觀察rAAV2對(duì)大鼠不同組織感染的情況，將rAAV2/hPPE經(jīng)上述三種途徑注射到慢性擠壓傷(chronicconstrictioninjury，CCI)疼痛模型大鼠體內(nèi)，測(cè)痛并觀察注射后大鼠感覺異常和痛覺過敏的變化，用RT-PCR方法測(cè)定大鼠

5、注射后各組織hPPE的表達(dá)，用放射免疫方法測(cè)定大鼠器官組織中亮氨酸-腦啡肽(L-EK)的含量。 結(jié)果： 1.獲得了高滴度(2.5×1012v.g./ml)和高純度的病毒顆粒； 2.細(xì)胞轉(zhuǎn)染rAAV2/eGFP的結(jié)果顯示rAAV2在神經(jīng)元和神經(jīng)干細(xì)胞中轉(zhuǎn)染效率較高，于7～10天達(dá)到高峰，而對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率較低；病毒轉(zhuǎn)染后神經(jīng)干細(xì)胞的生物學(xué)特性未發(fā)生改變。神經(jīng)干細(xì)胞經(jīng)分化、傳代后eGFP的表達(dá)未受影響；和未轉(zhuǎn)

6、染的細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染rAAV2/hPPE后，各細(xì)胞hPPEmRNA的表達(dá)均增高，培養(yǎng)基上清中L-EK的含量顯著性增高[星形膠質(zhì)細(xì)胞：154±5Vs98±3(P＜0.01)；神經(jīng)元：377±9vs112±5(P＜0.01)；神經(jīng)干細(xì)胞：298±13Vs74±6(P＜0.01)]。 3.大鼠經(jīng)靜脈注射rAAV2/eGFP可使血管、骨骼肌等組織表達(dá)綠色熒光，經(jīng)脊髓注射和骨骼肌注射，僅在注射部位周圍發(fā)現(xiàn)熒光表達(dá)；和對(duì)照組相比，不同途徑注射

7、rAAV2/hPPE均能提高CCI大鼠的機(jī)械刺激和熱痛刺激的縮爪閾值；經(jīng)脊髓或骨骼肌注射rAAV2/hPPE，大鼠注射部位的組織內(nèi)hPPEmRNA表達(dá)增高，L-EK的含量增高[分別為235.0±25.5vs61.3±1.8(P＜0.01)；209±13vs0(P＜0.01)]。和對(duì)照組比，經(jīng)尾靜脈注射的大鼠hPPEmRNA的表達(dá)和L-EK的含量在脊髓、骨骼肌和血管壁均升高[L-EK含量分別為113.9±13.1vs61.3±1.8(P＜