青蒿琥酯對白血病K562細(xì)胞自噬的影響及其相關(guān)機(jī)制的研究.pdf

1、目的：
　　研究青蒿琥酯(Artesunate，ART)對白血病K562細(xì)胞自噬的影響，并初步探討其作用機(jī)制。
　　方法：
　　1）用不同濃度ART（分別為0、6.25、12.5、25、50、100mg/L）刺激K562細(xì)胞，采用CCK-8法分別檢測24h、48h、72h后K562細(xì)胞的增殖抑制，并計(jì)算其半數(shù)抑制濃度（inhibitory concentration，IC50）；
　　2）在IC50濃度下，用CC

2、K-8檢測空白對照組、自噬抑制劑二磷酸氯喹（Chloroquine diphosphate，CQ）組、ART+CQ組及ART組K562細(xì)胞的增殖抑制；
　　3）在IC50濃度下采用Annexin V-FITC／PI雙染法聯(lián)合流式細(xì)胞儀檢測上述4組細(xì)胞的凋亡率;
　　4）qRT-PCR檢測P62、HMGB1、Beclin1的相對mRNA表達(dá)量；
　　5）Western blot檢測不同濃度ART（分別為0、6.25、12

3、.5、25、50、100mg/L）作用 K562細(xì)胞48h，及 IC50濃度下ART作用 K562細(xì)胞12h、24h、48h、72h后 LC3、P62、HMGB1、Beclin1蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1）隨著ART濃度的增加和作用時(shí)間的延長，ART對K562細(xì)胞的增殖抑制愈強(qiáng)；24h、48h、72h的IC50分別為60mg/L、30mg/L、8.5mg/L，并選取48h的IC50進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　2）空白對照

4、組、CQ組、ART+CQ組及ART組K562細(xì)胞的增殖抑制率分別為0.000％±2.151、7.15%±2.13、70.846%±5.572、34.067%±7.322，可見ART組增殖抑制率相對于空白對照組及CQ組明顯升高，差異均顯著（p<0.05）,同時(shí)ART+CQ組的增殖抑制率也顯著高于ART組（p<0.05）。
　　3）Annexin V-FITC／PI雙染法聯(lián)合流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示空白對照組、CQ組、ART+CQ組及ART

5、組K562細(xì)胞的凋亡率分別是1.92%±0.09、8.28%±0.97、16.67%±1.34、9.48%±1.00，ART組較空白對照組，凋亡率顯著升高（p<0.05）；同時(shí)ART+CQ組與ART組比較，凋亡率也明顯增高（p<0.05）。
　　4）qRT-PCR顯示30mg/L ART作用K562細(xì)胞48h后HMGB1、Beclin1 mRNA表達(dá)水平分別為0.40±0.06、0.521±0.07，明顯低于對照組1.00±0.0

6、0，差異顯著（p<0.05）；而P62 mRNA表達(dá)水平為2.13±0.05，顯著高于對照組1.00±0.00，p<0.05；
　　5）Western blot結(jié)果顯示隨著ART濃度的增加以及作用時(shí)間的延長，自噬相關(guān)分子 LC3、P62的表達(dá)水平上調(diào)，而 HMGB1、Beclin1表達(dá)水平下調(diào)。
　　結(jié)論：
　　ART以時(shí)間劑量依賴性方式抑制K562細(xì)胞自噬。ART抑制K562細(xì)胞自噬的可能機(jī)制是通過抑制自噬體的融合降