人可溶性DC-SIGN單多抗雙夾心ELISA檢測體系的建立與初步應(yīng)用.pdf

1、樹突狀細(xì)胞(Dendritic cell，DC)是目前研究所知體內(nèi)功能最強(qiáng)大的專職抗原提呈細(xì)胞，其既能啟動(dòng)初始免疫應(yīng)答，亦能調(diào)控免疫反應(yīng)強(qiáng)弱，具有重要的免疫調(diào)節(jié)功能。DC-SIGN是DC表面Ⅱ型跨膜受體，屬于C型凝集素受體超家族成員，由糖識別域(Carbohydrate Recognition Domain，CRD)、頸區(qū)、跨膜區(qū)和胞漿區(qū)等4個(gè)結(jié)構(gòu)域組成。CRD參與識別并結(jié)合細(xì)胞或病原體表面的糖基包括:巖藻糖、Lewis糖、甘露糖等;胞

2、漿區(qū)主要參與抗原的內(nèi)吞。DC-SIGN可與T細(xì)胞表面細(xì)胞問黏附分子3（intercellular adhesion molecule3，ICAM-3）結(jié)合，參與初始T細(xì)胞的活化;亦能與血管內(nèi)皮細(xì)胞上的細(xì)胞間黏附分子2(intercellular adhesion molecule2，ICAM-2)結(jié)合，介導(dǎo)DC的粘附與遷移。最近報(bào)道人體液（例如:血清、關(guān)節(jié)滑液和支氣管肺泡灌洗液等）中存在sDC-SIGN，且在炎癥刺激下其濃度顯著升高，研

3、究發(fā)現(xiàn)sDC-SIGN可促進(jìn)CMV感染DC。鑒于膜型DC-SIGN在啟動(dòng)獲得性免疫應(yīng)答和病原體感染中的關(guān)鍵作用，推測sDC-SIGN亦具有重要的牛物學(xué)意義。2001年Mummidi等發(fā)現(xiàn)短截sDC-SIGN mRNA，但置于CHO細(xì)胞中不表達(dá)sDC-SIGN。課題組在前期工作中構(gòu)建了DC-SIGN胞外段（aa61～aa404，含頸區(qū)和CRD區(qū)）原核表達(dá)載體，獲得了DC-SIGN的胞外段蛋白并制備了兩株單克隆抗體(4H3、1C6)。在本次

4、研究中，我們通過制備抗DC-SIGN胞外段蛋白的多克隆抗體同時(shí)表達(dá)無融合標(biāo)簽的DC-SIGN胞外段蛋白，建立sDC-SIGN單多抗雙夾心ELISA檢測體系，通過比較健康人群和病毒感染及腫瘤患者血清中sDC-SIGN差異探索DC-SIGN的病理生理學(xué)意義，為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。本研究分為三個(gè)部分：
　　 第一章：融合蛋白sDC-SIGN-GST的表達(dá)及其多克隆抗體的制備。本課題組前期工作將重組質(zhì)粒PET41 a-sDC-SIGN轉(zhuǎn)化

5、至大腸桿菌BL21并進(jìn)行表達(dá)，經(jīng)抗GST柱純化已得到融合蛋白sDC-SIGN-GST。為了得到其多克隆抗體，利用該融合蛋白免疫兩只2kg左右的雌性家兔（同時(shí)設(shè)立對照），家兔經(jīng)三次背部皮下多點(diǎn)免疫，兩次靜脈加強(qiáng)免疫后，行耳緣靜脈取血1～3ml，對抗血清行間接ELISA檢測兩只家兔的抗血清效價(jià)均在1×106以上。此時(shí)，對家兔行頸動(dòng)脈放血，4℃靜置保存并于次日離心獲得約150ml抗血清。選用飽和硫酸銨法對抗血清進(jìn)行粗提，純化后的多克隆抗體經(jīng)蛋

6、白定量后經(jīng)SDS-PAGE和Western bolt凝膠電泳分析，證實(shí)多克隆抗體可以和融合蛋白sDC-SIGN-GST特異性結(jié)合。實(shí)驗(yàn)利用融合蛋白sDC-SIGN-GST，免疫家兔成功得到效價(jià)高特異性好的抗血清，為后續(xù)雙夾心ELISA檢測體系的建立做好準(zhǔn)備。
　　 第二章：PET17b-sDC-SIGN重組質(zhì)粒的構(gòu)建及其蛋白表達(dá)。由于以PET41a為載體表達(dá)出的融和蛋白sDC-SIGN-GST含有較大的GST標(biāo)簽蛋白，為了使后續(xù)

7、對蛋白sDC-SIGN生物活性的研究更具說服力，實(shí)驗(yàn)中以PET17b為載體重新構(gòu)建重組質(zhì)粒PET17b-sDC-SIGN，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌進(jìn)行表達(dá)，以獲得不含標(biāo)簽蛋白的sDC-SIGN蛋白。以重組質(zhì)粒PET41 a-sDC-SIGN為模板，PCR擴(kuò)增獲得sDC-SIGN目的基因，分別對產(chǎn)物及載體PET17b用BamHⅠ、EcoRⅠ酶切后連接，未能成功，于是將PCR產(chǎn)物先連接至pMD18 T載體上，得到重組質(zhì)粒PMD18T-sDC-SIG

8、N，進(jìn)行PCR、雙酶切以及測序鑒定所插入目的基因正確后，分別對其和PET17b經(jīng)BamHⅠ、EcoRⅠ雙酶切后連接，獲得重組質(zhì)粒PET17b-sDC-SIGN。PET17b載體上含有強(qiáng)啟動(dòng)子T7，故采用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)外源蛋白。將PET17b-sDC-SIGN重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌克隆菌，挑取陽性克隆，并在大腸桿菌表達(dá)菌體中擴(kuò)增，當(dāng)菌量A600達(dá)到0.6-1.0時(shí)加入1mM IPTG誘導(dǎo)表達(dá)sDC-SIGN蛋白，希望得到可溶性表達(dá)，這樣

9、既可以省去復(fù)雜的蛋白變性和復(fù)性，重要的是蛋白如能以可溶性形式表達(dá)，其結(jié)構(gòu)及活性會更接近于天然蛋白。但sDC-SIGN仍主要以包涵體形式存在。對所制備的sDC-SIGN蛋白經(jīng)Western blot鑒定:分子質(zhì)量在38000，且可以與本室制備的抗人DC-SIGN mAb4H3以及商品化的抗DC-SIGN mAb(DCN46)特異性結(jié)合，證明該蛋白即我們所需的目的蛋白sDC-SIGN。采用間接ELISA方法檢測所表達(dá)蛋白sDC-SIGN的免

10、疫原性:包被sDC-SIGN蛋白，檢測抗體為4H3，酶標(biāo)二抗為HRP-抗小鼠IgG。然sDC-SIGN蛋白與單抗結(jié)合較弱，但實(shí)驗(yàn)中表達(dá)了不含標(biāo)簽蛋白的sDC-SIGN蛋白，為深入研究sDC-SIGN的活性及功能奠定了基礎(chǔ)。
　　 第三章：sDC-SIGN單多抗雙夾心ELISA檢測體系的建立及初步應(yīng)用。使用商品化來源于人體腎臟上皮細(xì)胞HEK293表達(dá)出的人N端胞外段DC-SIGN(Lys62～Ala404)蛋白作為夾心ELISA體

11、系的標(biāo)準(zhǔn)品。交叉配對選用合適的抗體對，方案如下：兩株單克隆抗體(4H3、1C6)和一株多克隆抗體，互為捕獲抗體和檢測抗體；多克隆抗體作為捕獲抗體，單抗4H3、1C6以及辣根過氧化酶和生物素標(biāo)記的兩株單克隆抗體作為檢測抗體。從14種配對方法中挑選靈敏度最高的一組。兩株抗sDC-SIGN單克隆抗體與純化兔抗sDC-SIGN多克隆抗體進(jìn)行組合，確定以單克隆抗體4H3作為包被抗體，多克隆抗體作為檢測抗體，相比較于其他組合可以獲得更好的靈敏度。單

12、多抗雙夾心ELISA檢測體系確立后，我們進(jìn)一步通過對體系中包被抗體濃度、檢測抗體濃度、封閉液及樣品稀釋液等條件予以優(yōu)化。最終選用封閉液為5％的脫脂奶粉，采用PBS-1％Tween+1％BSA作為單多抗雙夾心ELISA檢測體系的緩沖體系，以較少體系非特異性而降低本底值。同時(shí)對體系的靈敏度、特異性、檢測限及批間批內(nèi)穩(wěn)定性進(jìn)行檢測。結(jié)果表明:3個(gè)OD450點(diǎn)所代表的濃度值的變異系數(shù)均小于15％，表明標(biāo)準(zhǔn)曲線可重復(fù)性較好。體系批內(nèi)平均變異系數(shù)6

13、.8％，批間平均變異系數(shù)7.9％，均小于10％，說明本檢測體系的可重復(fù)性較好?？梢耘c制備的mAb4H3以及商品化DC-SIGN mAb(DNC46)結(jié)合。其體系的檢測靈敏度約為5ng/ml，檢測范圍5-100ng/ml。應(yīng)用該體系檢測人可溶性DC-SIGN在健康人群、大三陽、腸癌、慢性乙型肝炎患者血清中含量，并對其分別進(jìn)行兩獨(dú)立樣本率的x2檢驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示:慢性乙型肝炎感染者與健康人群血清中sDC-SIGN含量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.4