丙烯酰胺對(duì)神經(jīng)絲磷酸化有關(guān)的蛋白激酶及相關(guān)蛋白的影響.pdf

1、目的：
　　 丙烯酰胺(ACR)是一種用途廣泛的工業(yè)毒物。它是一種神經(jīng)毒性物質(zhì)和人類可能致癌物,它的神經(jīng)毒性主要表現(xiàn)為中樞.周圍性遠(yuǎn)端軸索病,臨床表現(xiàn)為共濟(jì)失調(diào)、骨骼肌無力,其病理特征是遠(yuǎn)端軸突腫脹、變性、神經(jīng)絲(neurofilament,NF)聚集:我們前面的研究發(fā)現(xiàn),ACR中毒大鼠坐骨神經(jīng)組織中NFs(包括NF-L、NF-M和NF-H)的含量均是下降的。但其神經(jīng)毒性的作用機(jī)制仍未完全闡明。
　　 基于ACR中毒NF

2、s及其超微結(jié)構(gòu)的改變,為進(jìn)一步探討ACR中毒性外周神經(jīng)病變發(fā)生的分子機(jī)制,我們建立了ACR亞慢性中毒大鼠模型,測(cè)定了坐骨神經(jīng)中與NFs磷酸化有關(guān)的三種蛋白激酶:蛋白激酶A(PKA)、蛋白激酶C(PKC)和細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶5(CDK5),及其相關(guān)蛋白包括鈣調(diào)蛋白(CaM)、環(huán)磷腺苷(cAMP)、CDK5的兩個(gè)激活因子P35和P25的變化。此外還對(duì)血清PKA和PKC的含量進(jìn)行了分析,以期為ACR神經(jīng)損傷生物標(biāo)志物的探索提供依據(jù)。

3、>　　 方法
　　 1.成年雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、低劑量組和高劑量組。低、高劑量組分別以20 mg/kg體重和40 mg/kg體重劑量腹腔注射ACR染毒,每周3次,連續(xù)8周；對(duì)照組腹腔注射等體積雙蒸水。
　　 2.神經(jīng)行為的改變和步態(tài)評(píng)分密切觀察各組大鼠的一般狀況和神經(jīng)行為的改變,測(cè)量大鼠體重,給出步態(tài)評(píng)分。
　　 3.分離坐骨神經(jīng)組織,勻漿后超速離心,取上清-80℃保存?zhèn)溆?。用SDS-PAGE和

4、Western Blotting方法測(cè)定PKA、PKC、CDK5、P35和P25蛋白含量；用ELISA試劑盒測(cè)定CaM和cAMP的含量。
　　 4.取大鼠坐骨神經(jīng)組織勻漿上清,利用放射性同位素技術(shù)研究ACR染毒對(duì)大鼠神經(jīng)組織中PKA和PKC活性的影響。
　　 5.斷頭取血,常規(guī)分離血清,利用SDS-PAGE和Western Blotting方法測(cè)定血清中PKA和PKC的含量。
　　 結(jié)果
　　 1.體重結(jié)

5、果與中毒表現(xiàn):與對(duì)照組相比,ACR染毒組大鼠體重減輕,高劑量組第5-8周體重下降(P<0.05)。高劑量組大鼠在染毒第8周后肢完全癱瘓,走路時(shí)后肢后拖,足背著地,無法支撐身體,步態(tài)得分增高；染毒終止時(shí),低、高劑量組分別呈輕度和重度受損步態(tài)。與對(duì)照組比較,ACR染毒組大鼠步態(tài)評(píng)分增高,低劑量組第8周出現(xiàn)增高(P<0.01),高劑量組第4-8周出現(xiàn)增高(P<0.01)。
　　 2.蛋白測(cè)定結(jié)果:與對(duì)照組相比,低劑量組和高劑量組坐骨神

6、經(jīng)中的蛋白激酶及其相關(guān)蛋白都發(fā)生了不同程度的變化。
　　 (1)坐骨神經(jīng)中CaM含量的變化:與對(duì)照組相比,低劑量組無明顯變化,高劑量組增高了50％(P<0.01)；與低劑量組相比,高劑量組升高了50％(P<0.01)。
　　 (2)坐骨神經(jīng)中cAMP含量的變化:cAMP蛋白含量在ACR亞慢性中毒大鼠坐骨神經(jīng)中明顯降低,與對(duì)照相比,cAMP在低劑量組降低了11％,在高劑量組降低了95％(P<0.01)；與低劑量組相比,cA

7、MP在高劑量組降低了94％(P<0.01)。
　　 (3)坐骨神經(jīng)中PKA和PKC的含量及活性的變化:與對(duì)照組相比,PKA和PKC的含量在低劑量組分別升高了18％和21％,在高劑量組分別增高了73％(P<0.01)和170％(p<0.01)；與低劑量組相比,這兩者的含量在高劑量組分別升高了46％(p<0.01)和125％(p<0.01)。PKA活性與對(duì)照組相比,低劑量組增高了60％(p<0.01),高劑量組降低了50％(P<0.

8、01)；與低劑量組相比,高劑量組降低了220％(p<0.01)。PKC活性與對(duì)照組相比,低劑量組增高了50％,高劑量組增高了6倍(p<0.01)；與低劑量組相比,高劑量組增高了3倍(p<0.01)。
　　 (4)坐骨神經(jīng)中CDK5、P25和P35含量的變化:與對(duì)照組相比,CDK5在低劑量組降低了51％(P<0.01),高劑量組降低了22％(p<0.05)；與低劑量組相比,高劑量組升高了59％(P<0.01)。P25和P35含量與

9、對(duì)照組相比,低劑量組分別降低了10％和21％(P<0.01),高劑量組分別降低了77％(p<0.01)和82％(P<0.01)；與低劑量組相比,高劑量組分別降低了74％(p<0.01)和77％(p<0.01)。
　　 (5)血清中PKC和PKA的含量與對(duì)照組相比,低劑量組分別升高了6％和6％,高劑量組分別升高了45％(p<0.01)和55％(p<0.01)；與低劑量組相比,高劑量組分別升高了37％(p<0.01)和47％(p<0

10、.01)。
　　 結(jié)論
　　 1.ACR亞慢性染毒可以引起神經(jīng)系統(tǒng)損傷,表現(xiàn)為大鼠步態(tài)評(píng)分異常。
　　 2.ACR染毒可明顯升高坐骨神經(jīng)組織中CaM含量,說明ACR可明顯增加細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度。
　　 3.坐骨神經(jīng)中蛋白激酶的變化可能與ACR的周圍神經(jīng)毒性有關(guān),表現(xiàn)為ACR亞慢染毒可明顯改變坐骨神經(jīng)中cAMP、PKA、PKC、CDK5、P35和P25蛋白的含量以及PKA和PKC的活性,從而導(dǎo)致NFs磷酸化