Rho蛋白激酶調控Ezrin磷酸化水平干預肝癌轉移的實驗研究.pdf

1、背景與目的：
　　肝細胞肝癌（Hepatocellularcarcinoma，HCC）是嚴重威脅人類健康的疾病，其發(fā)病率及死亡率高，轉移及復發(fā)風險大。在我國，肝癌的發(fā)病率和死亡率在所有的惡性腫瘤中排名第三，占全世界肝癌患者的42.5％。目前對于肝癌的治療策略和長期療效仍不甚理想。其在肝組織內的高復發(fā)率和癌組織向遠處組織的高轉移率是導致其治愈率低的主要原因。因此，深入揭示肝癌發(fā)生和轉移的分子生物學機制，闡明肝癌細胞惡性變的關鍵基因和

2、蛋白表達，對于戰(zhàn)勝這一臨床頑疾具有極其重要的科學意義。
　　在肝癌的進展過程中，多種蛋白的表達的改變參與了肝癌侵襲和轉移的調控。Ezrin（埃茲蛋白）是細胞膜上一類典型的膜-骨架連結蛋白，對細胞膜和細胞骨架相互作用的調節(jié)具有重要意義，有研究表明，Ezrin的表達及磷酸化水平與多種腫瘤的轉移和侵襲能力相關。本實驗擬通過蛋白質組學的研究方法及體內外實驗研究，探討Ezrin的表達及磷酸化調控與肝細胞癌的轉移侵襲能力之間的關系。
　

3、　方法與結果：
　　首先，通過收集第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院肝膽胰脾外科臨床肝癌手術中的肝癌原發(fā)組織及門脈轉移癌栓組織的病理標本，進行病理學、組織化學及蛋白質組學研究，我們比較了肝癌原發(fā)組織與門靜脈轉移癌栓中Ezrin蛋白磷酸化水平的差異，結果顯示，在門靜脈轉移癌栓中有大量的Ezrin發(fā)生了567位點蘇氨酸（Threonine,Thr）的磷酸化，原位癌中僅有少量Ezrin發(fā)生了Thr567的磷酸化，而在正常組織中則沒有檢測到發(fā)生Thr5

4、67酸磷酸化的Ezrin，這提示EzrinThr567的磷酸化水平可能與肝癌的轉移能力相關。
　　在此基礎上，我們用模擬Thr567不可磷酸化的突變體CFP-Ezrin567A及模擬567位磷酸化的突變體CFP-Ezrin567D轉染肝癌細胞HepG2，觀察肝癌細胞轉移侵襲能力的改變，實驗結果顯示，隨著Ezrin的磷酸化水平升高，HepG2的遷移能力隨之提高。通過使用Rho激酶的特異性抑制劑Y27632抑制ROCK的活性，并通過R

5、OCKsiRNA特異性抑制ROCK的表達，觀察其對肝癌細胞HepG2轉移的影響，實驗結果顯示，ROCK的活性被抑制，表達下調之后，EzrinThr567磷酸化水平降低，肝癌細胞轉移侵襲能力隨之下降。
　　為了驗證體內EzrinThr567磷酸化水平對肝癌轉移能力的影響，我們通過使用EzrinThr567不同表達水平的腺病毒載體質粒轉染MHCC97-H肝癌細胞系，包括CFP對照組、ezrin野生型、不可磷酸化EzrinT567A及磷

6、酸化EzrinT567D組，并進行裸鼠荷瘤實驗，實驗結果顯示，相對于野生型和CFP對照組，EzrinThr567D的磷酸化促進了肝癌細胞在裸鼠肝臟內的轉移。
　　結論：
　　本實驗首次發(fā)現(xiàn)伴隨肝癌轉移而產(chǎn)生的EzrinThr567的磷酸化，在高轉移性肝癌細胞系中，可檢測到的顯著區(qū)別于低轉移性細胞系的EzrinThr567的磷酸化的發(fā)生。EzrinThr567的磷酸化能引起細胞骨架重排，刺激細胞膜
　　產(chǎn)生皺褶，促進了H

7、epG2細胞的遷移。因而可以將EzrinThr567的磷酸化水平作為診斷肝癌轉移發(fā)生的標志。同時，本實驗還證實，在肝癌轉移中相伴發(fā)生的EzrinThr567的磷酸化受Rho激酶（ROCK）的調控，敲除該激酶或者抑制其活性均可以減少肝癌轉移的發(fā)生；另外，外源引入的EzrinThr567不可磷酸化的突變體EzrinT567A也可以競爭性的降低肝癌轉移的發(fā)生。
　　因此，我們設想Ezrin可以作為未來抑制肝癌轉移的新靶點，并可以通過抑制