地氟醚預(yù)處理對缺氧-復(fù)氧損傷內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用及其分子機(jī)制.pdf

1、第一部分:地氟醚預(yù)處理對缺氧/復(fù)氧損傷內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用 目的：了解缺氧/復(fù)氧(A/R)對人內(nèi)皮細(xì)胞的損傷作用，和地氟醚預(yù)處理對內(nèi)皮細(xì)胞的A/R損傷所起的保護(hù)作用。 方法：選用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株(ECV304)。將細(xì)胞分為5組：空白對照組(C組)，A/R組，A/R+腫瘤壞死因子-α(TNF-α，10ng/ml)刺激組(A/R+TNF-α組)，地氟醚1.0MAC預(yù)處理+A/R組(Des+A/R組)，地氟醚1.0MAC預(yù)處理

2、+A/R+TNF-α(10ng/ml)刺激組(Des+A/R+TNF-α組)。應(yīng)用流式細(xì)胞儀碘化丙啶(PI)染色法、原位缺口末端標(biāo)記(TUNEL)法、透射電鏡(EM)觀察法檢測各組內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡和壞死。 結(jié)果：A/R組較對照組中的細(xì)胞凋亡和壞死率有一定增加；經(jīng)TNF-α刺激后，A/R+TNF-α組的細(xì)胞凋亡和壞死率則顯著增加；而經(jīng)地氟醚預(yù)處理后，Des+A/R組、Des+AiR十TNF-α組細(xì)胞較相應(yīng)無預(yù)處理的A/R組、A/R+

3、TNF-α組，其細(xì)胞凋亡和壞死率有明顯減少：透射電鏡觀察到，A/R組和A/R+TNF-α組，可見較多的細(xì)胞壞死現(xiàn)象：細(xì)胞腫脹、細(xì)胞內(nèi)超微結(jié)構(gòu)破壞，大量空泡出現(xiàn)，核染色質(zhì)溶解或核碎裂、細(xì)胞膜破壞明顯。而兩組地氟醚預(yù)處理后的細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，胞內(nèi)有豐富的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體，核仁增多明顯，細(xì)胞處于增殖和修復(fù)狀態(tài)。 結(jié)論：地氟醚預(yù)處理可抑制內(nèi)皮細(xì)胞缺氧/復(fù)氧引起的細(xì)胞死亡、減少細(xì)胞損傷、加強(qiáng)細(xì)胞修復(fù)和增殖，從而具有一定的保護(hù)作用。第二部分：

4、 目的：探討預(yù)處理對內(nèi)皮細(xì)胞NF-kB活性的影響；并進(jìn)一步分析NF-kB信號通路中一系列關(guān)鍵轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白表達(dá)的變化，以明確地氟醚預(yù)處理對內(nèi)皮細(xì)胞A/R損傷所起保護(hù)作用的分子機(jī)制，為臨床麻醉實施中預(yù)防缺血再灌注損傷的麻醉藥物選擇提供實驗和理論依據(jù)。 方法：選用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株(ECV304)。將細(xì)胞分為5組：空白對照組(C組)，A/R組，A/R+腫瘤壞死因子-α(TNF-a，10ng/ml)刺激組(A/R+TNF-α組)，地氟

5、醚1.0MAC預(yù)處理+A/R組(Des+A/R組)，地氟醚1.0MAC預(yù)處理+A/R+TNF-α(10ng/ml)刺激組(Des+A/R+TNF-α組)。采用間接免疫熒光法檢測各組細(xì)胞中NF-kB/p65亞基的定位；應(yīng)用核漿分離技術(shù)和Western blot分析法檢測NF-kB/p65亞基在各組細(xì)胞核內(nèi)的蛋白表達(dá)水平；應(yīng)用Western blot分析法檢測各組細(xì)胞NF-kB信號途徑中，kB抑制因子-β(IkB-α)的降解以及磷酸化IkB

6、-α(p-IkB-α)、磷酸化IkB激酶α/β(p-IKKa/IKKβ)的表達(dá)；以腫瘤壞死因子受體1(TNFR1)抗體免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)并用Western blot法檢測各組細(xì)胞膜受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合體中，TNFR1與腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子2(tumor necrosis factor receptor-associatd factor 2，TRAF2)及IkB激酶α(IKKα)的蛋白結(jié)合水平；應(yīng)用

7、流式細(xì)胞術(shù)檢測各組內(nèi)皮細(xì)胞膜表面TNFRl的表達(dá)。 結(jié)果：間接免疫熒光分析法顯示對照組細(xì)胞NF-kB/p65亞基免疫熒光標(biāo)記分布于胞漿區(qū)；A/R組可見部分免疫熒光標(biāo)記由胞漿區(qū)轉(zhuǎn)入核區(qū)；經(jīng)TNF-α刺激后，A/R+TNF-α組細(xì)胞的NF-kB/p65亞基免疫熒光標(biāo)記幾乎全部入核；而經(jīng)地氟醚預(yù)處理后，Des+A/R組的免疫熒光標(biāo)記入核較A/R組有明顯減少；Des+A/R+TNF-α組的免疫熒光標(biāo)記的入核亦較相應(yīng)的A/R+TNF-α組

8、有明顯減少。應(yīng)用核漿分離技術(shù)、Western blot分析法定量檢測，進(jìn)一步確證了免疫熒光分析法的結(jié)果。Western blot分析法檢測各組細(xì)胞中IkBα含量，可見A/R組較對照組IkBa有一定減少；經(jīng)TNF-α刺激后，可見顯著減少；而經(jīng)地氟醚預(yù)處理后，Des+A/R組較A/R組的IkBa有顯著增加。同樣，Des+A/R+TNF-α組則較相應(yīng)未經(jīng)預(yù)處理的A/R+TNF-α組有顯著增加；而Des+A/R、Des+A/R+TNF-α組間無

9、顯著差異。同法，檢測細(xì)胞中p-IkBα、p-IKKα/IKKβ含量。結(jié)果提示，A/R組細(xì)胞中三種關(guān)鍵轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白含量均較對照組有一定增加；經(jīng)TNF-α刺激后，A/R+TNF-α組中可見顯著增加；而經(jīng)地氟醚預(yù)處理后，Des+A/R組較A/R組中p-IkBα含量有顯著減少；Des+A/R十TNF-α組亦較相應(yīng)未經(jīng)預(yù)處理的A/R+TNF-α組有顯著減少。應(yīng)用免疫共沉淀-Western blot法檢測各組細(xì)胞TNFR1與TRAF2及IKKα的蛋白

10、結(jié)合水平?？梢夾/R組細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合體中招募TRAF2蛋白及激活I(lǐng)KKα蛋白的含量較對照組有一定增加：經(jīng)TNF-α刺激后，A/R+TNF-α組中可見顯著增加；而經(jīng)地氟醚預(yù)處理后，Des+A/R組較A/R組中所招募TRAF2及激活I(lǐng)KKα的蛋白含量有顯著減少；Des+A/R+TNF-α組亦較相應(yīng)未經(jīng)預(yù)處理的A/R+TNF-α組有顯著減少。應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測了內(nèi)皮細(xì)胞膜表面TNFR1的表達(dá)，可見未經(jīng)處理的對照組細(xì)胞，其膜表面的TNFR1呈高表

11、達(dá)；缺氧/復(fù)氧損傷后，受體表達(dá)沒有明顯變化；經(jīng)TNF-α外源性刺激后，受體內(nèi)吞顯著加強(qiáng)，參與介導(dǎo)激活NF-kB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路；而經(jīng)地氟醚預(yù)處理的后兩組，分別與相對應(yīng)的無預(yù)處理組比較，其膜表面TNFR1的表達(dá)無顯著性差異；即使是經(jīng)過地氟醚預(yù)處理的內(nèi)皮細(xì)胞，其在外源性TNF-α刺激下，仍可見受體內(nèi)吞有顯著加強(qiáng)。 結(jié)論：A/R損傷可激活內(nèi)皮細(xì)胞中NF-kB的活性，而地氟醚預(yù)處理可抑制這種由TNF-α介導(dǎo)的NF-kB信號通路的激活。這一調(diào)

12、節(jié)作用可能是地氟醚預(yù)處理對內(nèi)皮細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷所起保護(hù)作用的分子機(jī)制之一。而地氟醚預(yù)處理對NF-kB出信號通路產(chǎn)生抑制的始動作用位點，在于TNF膜受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合體中對TNFR1對于TRAF2蛋白的招募，而非影響膜受體TNFR1本身的表達(dá)。第三部分：地氟醚預(yù)處理對缺氧/復(fù)氧損傷時NF-kB轉(zhuǎn)導(dǎo)通路效應(yīng)分子的影響 目的：了解地氟醚預(yù)處理對內(nèi)皮細(xì)胞A/R損傷時炎性介質(zhì)分子和黏附分子表達(dá)的變化趨勢，探討預(yù)處理對于NF-kB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)

13、通路激活后的效應(yīng)分子的影響。 方法：選用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株(ECV304)。將細(xì)胞分為5組：空白對照組(C組)，A/R組，A/R+腫瘤壞死因子-α(TNF-α，10ng/ml)刺激組(A/R+TNF-α組)，地氟醚1.0MAC預(yù)處理+A/R組(Des+A/R組)，地氟醚1.0MAC預(yù)處理+A/R+TNF-α(10ng/ml)刺激組(Des+A/R+TNF-α組)。應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法分別檢測各組細(xì)胞的細(xì)胞間