乙醛脫氫酶1A2的表達(dá)和分布與SOD1-G93A轉(zhuǎn)基因小鼠脊髓神經(jīng)元的死亡密切相關(guān).pdf

1、背景與目的：
　　肌萎縮側(cè)索硬化癥（ALS）是一種累及腦與脊髓上下運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元，以進(jìn)行性和選擇性損傷運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元為主要特點(diǎn)的致死性神經(jīng)變性病。起病隱匿，患者常在3-5年內(nèi)因呼吸肌麻痹而致死，預(yù)后很差，而且目前無(wú)針對(duì)其特異性的診斷和治療方法。目前，力魯唑是由美國(guó)FDA批準(zhǔn)的目前唯一在人群中得到證實(shí)對(duì)肌萎縮側(cè)索硬化癥有效的藥物，但也只能延緩2-3月的壽命，且耗資巨大。肌萎縮側(cè)索硬化癥的發(fā)病機(jī)制尚不完全明確，近年來(lái)大量學(xué)者對(duì)肌萎縮側(cè)索硬化癥

2、致病蛋白進(jìn)行了研究，但多數(shù)是重復(fù)性驗(yàn)證研究，已發(fā)現(xiàn)的致病蛋白只能解釋肌萎縮側(cè)索硬化癥的部分發(fā)病機(jī)制。找到敏感的疾病相關(guān)蛋白，不僅可以達(dá)到早期診斷ALS、跟蹤疾病進(jìn)展、評(píng)估治療后的反應(yīng)的目的以及更好地理解ALS的分子發(fā)病機(jī)制，同時(shí)也為此后進(jìn)一步闡明SOD1-G93A突變相關(guān)ALS的生物通路和分子機(jī)制建立基礎(chǔ)，很多學(xué)者均致力于尋找關(guān)于ALS的疾病相關(guān)蛋白的研究。我們這項(xiàng)研究主要也是尋找與肌萎縮側(cè)索硬化癥發(fā)病相關(guān)的新蛋白。我們前期應(yīng)用iTRA

3、Q技術(shù)對(duì)SOD1-G93A轉(zhuǎn)基因小鼠的腦和脊髓進(jìn)行了蛋白組學(xué)分析，篩選出在腦和脊髓中表達(dá)均有差異且意義較大的蛋白，然后應(yīng)用免疫熒光及Western技術(shù)對(duì)篩選出的蛋白進(jìn)行探查，分析ALDH1A2在SOD1-G93A轉(zhuǎn)基因小鼠脊髓中表達(dá)和分布的規(guī)律，并分析ALDH1A2陽(yáng)性細(xì)胞在神經(jīng)細(xì)胞的共定位。
　　方法：
　　將正常的C57BL/6J小鼠與SOD1*G93A轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行交配繁殖，構(gòu)建動(dòng)物模型，用PCR技術(shù)檢測(cè)和篩選SOD1

4、-G93A陽(yáng)性子代小鼠，采用Western blot對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠ALDH1A2陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)量進(jìn)行分析；利用熒光免疫組織化學(xué)單標(biāo)技術(shù)對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠ALDH1A2陽(yáng)性細(xì)胞的分布特征進(jìn)行觀察和分析，應(yīng)用Image-Pro Plus6.0軟件對(duì)ALDH1A2陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)、計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；采用免疫熒光雙標(biāo)記技術(shù)，分別標(biāo)記神經(jīng)元細(xì)胞（Fox3/NeuN）、少突膠質(zhì)細(xì)胞（Oligodendrocyte）、星形膠質(zhì)細(xì)胞（GFAP）

5、、小膠質(zhì)細(xì)胞（IBA-1），用熒光免疫組織化學(xué)染色法對(duì)每一解剖區(qū)同時(shí)進(jìn)行雙重染色，然后利用圖像處理技術(shù)將染色的陽(yáng)性細(xì)胞疊加成像，在顯微鏡下觀察和分析陽(yáng)性細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞的共定位關(guān)系。
　　結(jié)果：
　　本研究是首個(gè)針對(duì)ALDH1A2與ALS相關(guān)性的研究，得到以下結(jié)果：
　?。?）ALDH1A2的前期iTRAQ分析結(jié)果
　　本實(shí)驗(yàn)室前期iTRAQ分析結(jié)果，與正常野生型小鼠相比，ALDH1A2是一種在SOD1-G93A轉(zhuǎn)

6、基因小鼠腦和脊髓中均有表達(dá)的差異蛋白，表達(dá)水平呈現(xiàn)如下規(guī)律：在SOD1-G93A進(jìn)展組小鼠及正常對(duì)照組小鼠脊髓組織中的豐度比為0.63，實(shí)驗(yàn)組<對(duì)照組;在實(shí)驗(yàn)組中，未發(fā)病組<進(jìn)展組<發(fā)病組。
　?。?）Western blot的驗(yàn)證結(jié)果
　　與前期 iTRAQ蛋白組學(xué)分析的結(jié)果完全一致，即對(duì)照組小鼠脊髓中ALDH1A2的表達(dá)水平高于實(shí)驗(yàn)組小鼠脊髓。
　?。?）免疫熒光雙標(biāo)實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證結(jié)果
　　觀察到ALDH1A2陽(yáng)

7、性細(xì)胞與FOX3/NeuN、IBA1、Oligodendrocyte、GFAP陽(yáng)性細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠脊髓灰質(zhì)內(nèi)均存在共定位，說(shuō)明了ALDH1A2能在上述四種細(xì)胞中表達(dá)。
　　（4）免疫熒光單標(biāo)實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證結(jié)果
　　ALDH1A2陽(yáng)性細(xì)胞廣泛分布于實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠的脊髓灰質(zhì)和白質(zhì)內(nèi)。
　　疾病作為獨(dú)立影響因素時(shí)，ALDH1A2陽(yáng)性細(xì)胞百分率對(duì)照組＞實(shí)驗(yàn)組，兩組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.02）；節(jié)段作為獨(dú)立影響因素

8、時(shí)，ALDH1A2陽(yáng)性細(xì)胞百分率頸段＞胸段＞腰段，三組比較有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.00），兩兩比較除頸段和胸段相比無(wú)明顯差異外，頸段和腰段相比、胸段和腰段相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；區(qū)域作為獨(dú)立影響因素時(shí)，白質(zhì)各區(qū)域＞灰質(zhì)各區(qū)域，六組比較有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.00），灰白質(zhì)之間兩兩相比無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；年齡作為獨(dú)立影響因素時(shí)，ALDH1A2陽(yáng)性細(xì)胞百分率發(fā)病組＞進(jìn)展組＞未發(fā)病組，三組比較有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.00），且兩兩比較均有統(tǒng)計(jì)

9、學(xué)差異；年齡和疾病因素對(duì)小鼠脊髓ALDH1A2陽(yáng)性細(xì)胞百分率的影響存在交互作用，一個(gè)影響因素的變化均可引起另一個(gè)因素的變化。
　　結(jié)論：
　　ALDH1A2蛋白在SOD1-G93A轉(zhuǎn)基因小鼠及正常對(duì)照小鼠脊髓不同解剖區(qū)域、不同節(jié)段、不同年齡階段的表達(dá)和分布規(guī)律：ALDH1A2陽(yáng)性細(xì)胞廣泛分布于對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組小鼠的脊髓灰質(zhì)和白質(zhì)內(nèi)，當(dāng)年齡、解剖區(qū)域、疾病、節(jié)段作為獨(dú)立因素存在時(shí)，均可影響小鼠脊髓ALDH1A2的陽(yáng)性細(xì)胞百分率，