2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、目的:肌萎縮側(cè)索硬化(Amyotrophic Lateral Sclerosis,ALS)是一種進(jìn)行性的神經(jīng)系統(tǒng)退行性變性疾病,累及大腦皮層運(yùn)動神經(jīng)元、脊髓前角細(xì)胞及腦干運(yùn)動神經(jīng)核。主要特征為選擇性上、下運(yùn)動神經(jīng)元丟失,出現(xiàn)進(jìn)行性加重的肌肉萎縮、肌無力及錐體束征。其感覺系統(tǒng)一般不受侵犯。病人多在發(fā)病3-5年后由于延髓麻痹、呼吸肌麻痹或肺部感染而死亡。目前尚無有效治療方法。Riluzole是目前唯一被批準(zhǔn)用于ALS治療的藥物,但它僅可以延

2、緩ALS的進(jìn)展,不能改善癥狀或逆轉(zhuǎn)進(jìn)行性惡化的趨勢。雖然ALS發(fā)病機(jī)制目前還不清楚,但普遍認(rèn)為與遺傳環(huán)境因素、氧化應(yīng)激、線粒體的功能失常、興奮性氨基酸的毒性作用、鈣穩(wěn)態(tài)的失衡、蛋白質(zhì)的異常聚集等有關(guān)。10%的病人為家族性ALS(fALS),90%為散發(fā)性ALS(sALS)。fALS和sALS的臨床表現(xiàn)非常相似,約20%的fALS和4%的sALS患者攜帶有銅/鋅超氧化物歧化酶(SODl)的基因突變,其中以G93A突變位點(diǎn)最多,而轉(zhuǎn)入人突變

3、的SODl G93A的小鼠,因有與人類似的臨床發(fā)病特點(diǎn)而成為世界上公認(rèn)的研究ALS的動物模型。 鐵是體內(nèi)最豐富的微量元素,由于其獨(dú)特化學(xué)反應(yīng)活性,在維持細(xì)胞和機(jī)體正常代謝過程中起著至關(guān)重要的作用,如:氧的輸送、線粒體的氧化反應(yīng)、神經(jīng)遞質(zhì)和DNA合成等。然而,游離的二價鐵離子能通過Fenton反應(yīng)生成具有高度反應(yīng)性的羥自由基,導(dǎo)致氧化應(yīng)激,從而損害機(jī)體的一些基本成分,如脂質(zhì)、蛋白、DNA等,導(dǎo)致細(xì)胞損傷。所以維持機(jī)體內(nèi)鐵的平衡對于

4、機(jī)體是非常重要的。細(xì)胞內(nèi)存在著精細(xì)的調(diào)節(jié)鐵的機(jī)制,其中鐵蛋白(Ferritin)是鐵代謝的關(guān)鍵蛋白,可以結(jié)合游離的二價鐵離子,防止Fenton反應(yīng),限制鐵催化的羥自由基的生成及后續(xù)的氧化應(yīng)激反應(yīng),從而防止細(xì)胞損傷的發(fā)生。Ferritin的改變在一定程度上代表了鐵代謝的紊亂。Ferritin又是Nrf2/ARE信號通路下游的一種抗氧化蛋白,可以被誘導(dǎo)而發(fā)揮抗氧化應(yīng)激的作用。Ferritin由H鏈和L鏈組成,H鏈有亞鐵氧化酶作用,它催化可溶

5、的二價鐵離子氧化為不溶的三價鐵離子,在鐵的迅速解毒和細(xì)胞內(nèi)鐵的運(yùn)輸中起主要作用。Ferritin受細(xì)胞內(nèi)鐵濃度的調(diào)節(jié),鐵水平低時,F(xiàn)erritin表達(dá)減少;鐵增多時,F(xiàn)erritin表達(dá)增加。文獻(xiàn)報道在ALS病人大腦某些區(qū)域及脊髓前角運(yùn)動神經(jīng)元的胞核和胞漿中檢測到鐵離子水平增加。Mary K用基因芯片的方法發(fā)現(xiàn)在SOD1 G93A小鼠四月齡時脊髓中FerritinL鏈和H鏈的mRNA升高。Strey CW等用雙向凝膠電泳和質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)S

6、OD1 G93A小鼠晚期與對照組小鼠相比,脊髓勻漿中Ferritin H鏈表達(dá)增加,說明鐵穩(wěn)態(tài)的改變在ALS發(fā)病中發(fā)揮了重要的作用。Annie S.Wu等發(fā)現(xiàn)給SOD1G93A小鼠腹膜內(nèi)注射鐵卟啉,不論是早期給藥還是癥狀出現(xiàn)時再給藥(與病人開始治療的時間類似)都能明顯改善SOD1 G93A小鼠的運(yùn)動功能、延長其存活期。 本實(shí)驗用世界上公認(rèn)的ALS動物模型SOD1 G93A小鼠作為研究對象,研究不同時期小鼠骨骼肌中Ferritin

7、 H鏈的變化,尋求ALS的標(biāo)記蛋白,探討鐵代謝在ALS發(fā)病中的作用,為臨床早期診斷、治療提供實(shí)驗室依據(jù)。 方法: 1、轉(zhuǎn)基因鼠的繁殖所有動物均飼養(yǎng)在恒溫(25-27℃)、恒濕和無特定病原菌(Specific pathogen free,SPF)環(huán)境中,喂以滅菌的SPF級顆粒型鼠類飼料。為維持B6SJL-TgN(SOD1 G93A)1 Gur轉(zhuǎn)基因小鼠突變基因穩(wěn)定下傳,將B6SJL SOD1 G93A/+半合子雄鼠與B6S

8、JLF1/J雌鼠交配繁殖。子代鼠經(jīng)基因鑒定確定是否帶有人突變的基因。 2、實(shí)驗分組依據(jù)SOD1 G93A小鼠的發(fā)病規(guī)律分為80天(癥狀前期)、120天(癥狀早期)和終末期3個時間點(diǎn)取材。終末期以SOD1 G93A小鼠仰臥20秒不能翻身為準(zhǔn)。每個時間點(diǎn)又設(shè)有模型組、對照組1和對照組2。模型組為SOD1 G93A小鼠,對照組1為Wild-type小鼠,對照組2為hSOD1轉(zhuǎn)基因小鼠。每組每個時間點(diǎn)3只小鼠。 3、觀察變化及取

9、材實(shí)驗期間每天觀察動物,每周稱體重一次。在SOD1 G93A小鼠生長80天、120天和終末期時新鮮取材,Wild-type小鼠和hSOD1小鼠分別在相應(yīng)時間點(diǎn)取材。用10%的水合氯醛0.1ml腹膜內(nèi)注射麻醉后,取腓腸肌,放入1.5ml EP管,液氮冷凍,然后置-80℃保存。 4、Ferritin H鏈的測定用western blotting的方法測定。首先提取肌肉組織中的蛋白,測定蛋白的濃度,計算出100μg所需要蛋白的μ 1數(shù)

10、,然后進(jìn)行SDS-PAGE電泳,100V恒壓轉(zhuǎn)膜2小時,5%脫脂奶粉封閉1小時,加入-抗4℃過夜,二抗避光孵育2小時,Odyssey Infrared Imaging System檢測,并計算出目的條帶與β-actin的比值,實(shí)驗數(shù)據(jù)以均值+標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,采用SAS軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析,組間比較采用Q檢驗,統(tǒng)計結(jié)果以P<0.05為有顯著性差異。結(jié)果: 1、子代鼠的鑒定:子代鼠基因組DNA的PCR產(chǎn)物電泳顯示:位于300-40

11、0bp之間有一條帶(324 bp),為內(nèi)參照IL-2的PCR產(chǎn)物;位于200-300bp之間的條帶(236bp),為突變SOD1基因的PCR產(chǎn)物。 2、臨床變化:在80天及以前SOD1 G93A小鼠與對照組小鼠一樣,無明顯臨床變化,在110天左右SOD1 G93A小鼠開始出現(xiàn)肢體震顫、無力,120天左右出現(xiàn)步態(tài)明顯異常、邁步的距離變短;隨后漸出現(xiàn)一側(cè)后肢行走時的拖拽現(xiàn)象和肌肉萎縮,整個后肢和后半身逐漸萎縮消瘦,不能支撐身體,雙側(cè)

12、后肢呈伸直樣,約在140-150天左右,小鼠四肢均受累,將其仰臥后20秒內(nèi)小鼠不能自行翻轉(zhuǎn),達(dá)終末期。Wild-type小鼠和hSOD1小鼠無上述表現(xiàn)、非?;钴S,與其他正常小鼠并無差別。 3、Ferritin H鏈的蛋白水平:與Wild-type小鼠和hSOD1小鼠相比,SOD1 G93A小鼠骨骼肌中Ferritin H鏈的表達(dá)在80天時沒有顯著變化(P>0.05),而在120天和終末期時,SOD1 G93A小鼠骨骼肌中Ferr

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