芳基硫酸酯酶B的表達與分布與SOD1 G93A轉(zhuǎn)基因小鼠神經(jīng)元死亡的相關性研究.pdf

1、背景與目的：
　　肌萎縮側(cè)索硬化癥（ALS）是一種以進行性和選擇性損傷的上下運動神經(jīng)元為主的慢性的致命性運動神經(jīng)元疾病，病變主要累及大腦皮層運動神經(jīng)元、脊髓前角細胞及腦干運動神經(jīng)核。ALS起病隱匿、預后很差，患者常在3-5年內(nèi)死于呼吸肌麻痹，目前尚無特異的診斷和治療方法。若能找到敏感的疾病相關蛋白，不僅能早期診斷ALS、跟蹤疾病進展、評估治療后的反應，還能幫助我們更好地理解ALS的分子發(fā)病機制。但目前已發(fā)現(xiàn)的致病蛋白只能部分解釋肌

2、萎縮側(cè)索硬化癥的可能發(fā)病機制。因此，這項研究主要為了尋找與肌萎縮側(cè)索硬化癥發(fā)病相關的新蛋白。
　　前期我們通過對SOD1-G93A轉(zhuǎn)基因小鼠的腦和脊髓進行蛋白組學分析找出差異蛋白，然后通過觀察野生型和SOD1 G93A轉(zhuǎn)基因小鼠脊髓在不同發(fā)病階段脊髓節(jié)段、區(qū)域以及神經(jīng)細胞中ARSB的表達和分布情況以便達到初步揭示ARSB在SOD1-G93A轉(zhuǎn)基因小鼠脊髓中分布規(guī)律，證實ARSB是ALS可能的疾病相關蛋白。
　　方法：

3、　　通過構(gòu)建B6SJL-Tg（SOD1*G93A）1Gur/J轉(zhuǎn)基因小鼠動物模型，通過與正常的C57BL/6J交配繁殖，用PCR技術檢測和篩選出SOD1-G93A陽性子代小鼠，進行ALS差異蛋白ARSB的驗證：
　?。?）Western blot的研究對象
　　12只小鼠，包括：攜帶SOD1-G93A基因的可發(fā)病1代9只小鼠，為實驗組，根據(jù)小鼠的神經(jīng)功能評分及年齡分為3個亞組：①未發(fā)病組（60-70天）；②發(fā)病組（90-10

4、0天）；③進展組（120-130天）。每組均為3只，正常野生型B6小鼠3只為為正常對照組，其鼠齡均為60-70天。
　　（2）Western blot實驗
　　剝?nèi)?2只小鼠的脊髓，提取小鼠的脊髓蛋白并進行濃度檢測。每次Western blot將比較實驗組和對照組共4只小鼠脊髓中的ARSB蛋白表達水平，重復3次。運用Quantity One軟件作相對光密度分析。
　　（3）免疫熒光實驗的研究對象
　　18只小鼠，

5、包括：攜帶SOD1-G93A基因的可發(fā)病1代小鼠9只為實驗組，根據(jù)小鼠神經(jīng)功能評分及年齡分為3個亞組：未發(fā)病組、發(fā)病組、進展組，每組3只；正常野生型B6小鼠9只為正常對照組，3個亞組按年齡分為：60-70天，90-100天，120-130天，每組3只。
　?。?）免疫熒光實驗
　　剝?nèi)?8只小鼠脊髓，制作冰凍切片，每組每一只小鼠的脊髓切片分別分為頸段、胸段及腰段。
　　免疫熒光單標實驗：每個節(jié)段共觀察9張脊髓切片。針對

6、每張切片，在熒光顯微鏡4×、10×、20×、40×放大倍數(shù)下觀察脊髓白質(zhì)和灰質(zhì)內(nèi)ARSB陽性細胞分布的概況；對有ARSB陽性細胞分布的脊髓灰質(zhì)，按照不同解剖區(qū)域，在20×放大倍數(shù)下對2個灰質(zhì)前角、2個灰質(zhì)后角及中央管周圍各取1個視野（即對一張脊髓切片共取5個視野），運用Image-Pro Plus6.0軟件，分析ARSB陽性細胞數(shù)、計算陽性細胞率。
　?。?）統(tǒng)計分析和圖像處理
　　通過SPSS17.0統(tǒng)計軟件包處理數(shù)據(jù)，所

7、有數(shù)據(jù)均采用“均數(shù)±標準差”來表示，采用析因設計方差分析法來進行統(tǒng)計分析，兩兩相比較采用Bonferroni法， P＜0.05被認為具有統(tǒng)計學意義。
　　ALS差異蛋白ARSB的驗證結(jié)果：
　?。?）Western blot的驗證結(jié)果
　　在ARSB的表達中對照組<實驗組，且實驗組的表達隨病情的進展而上調(diào)。
　?。?）免疫熒光實驗的驗證結(jié)果
　　ARSB陽性細胞廣泛存在于實驗組和對照組小鼠的脊髓灰質(zhì)內(nèi)，在脊

8、髓白質(zhì)內(nèi)ARSB陽性細胞的未見表達。
　　實驗組小鼠脊髓ARSB陽性細胞的分布特征：在實驗組小鼠的頸段，在中央管周圍、灰質(zhì)前角和灰質(zhì)后角區(qū)域，不同疾病階段的小鼠，其ARSB陽性細胞百分率有顯著差異，且隨病情的進展而增高。
　　對照組小鼠脊髓中ARSB陽性細胞的分布特征：在對照組小鼠的頸段和胸段，60-70天年齡段的小鼠在中央管、灰質(zhì)前角、灰質(zhì)后角3個不同解剖區(qū)域內(nèi)的ARSB陽性細胞百分率有顯著差異，且灰質(zhì)前角>灰質(zhì)后角>中央

9、管。在對照組小鼠的腰段，不同年齡段的小鼠，其灰質(zhì)后角區(qū)域ARSB陽性細胞百分率有顯著差異，且呈隨年齡增加而增高的趨勢。
　　疾病作為獨立因素存在時，對小鼠脊髓ARSB的陽性細胞百分率有影響，且極其顯著（P=0.00），無論在實驗組小鼠脊髓的頸段、胸段還是腰段，在同一解剖區(qū)域內(nèi)其脊髓ARSB陽性細胞百分率平均值均高于正常對照組。解剖區(qū)域作為獨立因素存在時，對小鼠脊髓ARSB的陽性細胞百分率有影響（P=0.01）， ARSB陽性細胞的

10、分布在不同解剖區(qū)域內(nèi)的變化規(guī)律為：灰質(zhì)前角>中央管>灰質(zhì)后角。
　　結(jié)論：
　　本研究是首個基于SOD1-G93A轉(zhuǎn)基因小鼠模型、運用Western blot、免疫熒光技術進行ALS疾病相關致病蛋白的系統(tǒng)性研究，得出結(jié)論如下：
　　首次闡明ARSB蛋白在SOD1-G93A轉(zhuǎn)基因小鼠及正常對照小鼠脊髓不同不同節(jié)段、解剖區(qū)域及不同年齡時的表達和分布規(guī)律：ARSB蛋白在SOD1-G93A轉(zhuǎn)基因小鼠中的表達高于正常對照小鼠，并