核心蛋白聚糖（decorin）在屈肌腱愈合中作用的實驗研究.pdf

1、目的：肌腱損傷術(shù)后愈合發(fā)生粘連，導(dǎo)致手的功能恢復(fù)效果不理想，是手外科領(lǐng)域亟待解決的一大難題。近來研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β)在粘連形成和膠原原纖維形成過程中起到一個關(guān)鍵的生長因子的作用。核心蛋白聚糖(decorin，DCN)作為體內(nèi)自身正常的TGF-β調(diào)節(jié)因子，能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附、遷移、增殖和膠原纖維的形成，起著生理狀態(tài)下的抑制纖維化粘連的作用。本課題的目的是通過體內(nèi)和體外動物實驗，研究DCN在肌腱愈合過程中的機(jī)制，為將來臨床的進(jìn)

2、一步應(yīng)用提供理論依據(jù)。 方法：原代培養(yǎng)兔肌腱細(xì)胞，分別加入不同濃度(0.25、1.25、2.5、5μg/ml)的DCN；培養(yǎng)12、24、48h用二甲基噻唑二苯基四唑溴鹽(MTT)法測定細(xì)胞增殖速度；2.5μg/ml的DCN作用兔肌腱細(xì)胞24h后，鏡下觀察低濃度DCN作用24h后對兔肌腱細(xì)胞增殖的影響；2.5μg/ml的低濃度DCN培養(yǎng)兔肌腱細(xì)胞24h后用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。 原代培養(yǎng)大鼠肌腱細(xì)胞，2.5μg/ml的D

3、CN作用大鼠肌腱細(xì)胞12h后，采用免疫細(xì)胞化學(xué)，免疫熒光方法觀察DCN對大鼠肌腱細(xì)胞I型膠原蛋白的影響，采用半定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)方法檢測DCN對大鼠肌腱細(xì)胞Ⅰ型膠原mRNA表達(dá)的影響。 體外研究兔屈肌腱術(shù)后愈合過程中，DCN在形態(tài)和功能上對肌腱愈合效果的提高作用。選取成年日本大耳白兔18只。按術(shù)后不同時間隨機(jī)分成2、4、8周組，每組6只。①取兔后肢的第2趾，暴露深屈肌腱，橫行切斷。右側(cè)肌腱縫合位點直接注射核心

4、蛋白聚糖100μl(0.25g/L)為實驗趾；左側(cè)肌腱縫合位點注射磷酸鹽緩沖液100μl為對照趾。石膏固定。②各組兔肌腱大體粘連性狀觀察：于術(shù)后2、4、8周分別暴露粘連組織、腱鞘和肌腱，觀察肌腱粘連形狀(肌腱粘連分為5級，Ⅰ級為無粘連，Ⅴ級為廣泛粘連)。③各組兔肌腱縫合段組織學(xué)觀察：于術(shù)后2、4、8周取實驗趾和對照趾肌腱縫合區(qū)切片。隨機(jī)取2個標(biāo)本切片做蘇木精伊紅染色觀察成纖維細(xì)胞計數(shù)；2個標(biāo)本切片做Masson色染色觀察膠原纖維含量；2

5、個標(biāo)本行透射電鏡觀察肌腱愈合中成纖維細(xì)胞及膠原纖維的超微結(jié)構(gòu)。 結(jié)果：體外實驗，0.25、1.25、2.5μg/ml濃度DCN作用12h后對兔肌腱細(xì)胞增殖有著減少的趨勢，但是24h后卻明顯地促進(jìn)其增殖(P＜0.05)，但是48h后差異不顯著。而5μg/ml濃度組作用12h對兔肌腱細(xì)胞增殖有著增加的趨勢，24h后促進(jìn)增殖作用顯著(P＜0.05)48h后卻抑制兔肌腱細(xì)胞的增殖。2.5μg/ml低濃度DCN作用兔肌腱細(xì)胞24h后鏡下觀

6、察和流式細(xì)胞分析，細(xì)胞增殖明顯增強(qiáng)，S期增加，PI明顯大于對照組(P＜0.05)。 DCN早期作用大鼠肌腱細(xì)胞，免疫細(xì)胞化學(xué)發(fā)現(xiàn)能夠明顯減少肌腱細(xì)胞的Ⅰ型膠原蛋白的合成，免疫熒光定量分析實驗組和對照組相差顯著；DCN早期還能夠顯著下調(diào)肌腱細(xì)胞Ⅰ型膠原蛋白mRNA水平的表達(dá)。 體內(nèi)動物實驗結(jié)果如下。18只兔均進(jìn)入結(jié)果分析。①兔肌腱大體粘連性狀觀察結(jié)果：8周組，實驗趾吻合口光滑，愈合良好，Ⅰ、Ⅱ級粘連，肌腱滑動性好；對照趾吻

7、合口形成Ⅳ、Ⅴ級粘連，與腱鞘很難分離，肌腱滑動性極差。②兔肌腱縫合段成纖維細(xì)胞計數(shù)結(jié)果：2周組實驗趾顯著少于對照趾[(708.67±73.30)vs(4289.33±55.79)個/視野]。4周組實驗趾多于對照趾[(734.83±192.91)vs(3322.33±183.32)個/視野]。8周組實驗趾和對照趾無明顯差異[(3525.17±166.36)vs0267.50±167.91)個/視野]。③兔肌腱縫合段膠原纖維含量觀察結(jié)果：光

8、鏡下觀察，8周組實驗趾膠原纖維含量明顯增多，排列規(guī)則，膠原束直徑一致，膠原纖維成熟；對照趾膠原纖維不規(guī)則，膠原束直徑大小不一，成熟度有所增加。④兔肌腱縫合段超微結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果：8周組實驗趾膠原原纖維成熟排列規(guī)則、粗細(xì)均勻，纖維周期橫紋清晰，腱細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)空泡減少；對照趾膠原原纖維不排列纖維周期橫紋不清晰，腱細(xì)胞活躍，胞突增多，胞質(zhì)內(nèi)大量空泡。 結(jié)論：體外實驗，低、中濃度DCN對兔肌腱細(xì)胞的增殖起著先延遲后促進(jìn)的作用，提示在肌腱愈合中

9、如果在肌腱和腱鞘之間運用DCN，可能起到早期隔離TGF-β對腱鞘成纖維細(xì)胞的作用，而后期增強(qiáng)TGF-β對腱內(nèi)膜細(xì)胞的作用，從而促進(jìn)內(nèi)源性愈合，減少外源性愈合，達(dá)到減少粘連的效果。而且DCN早期在蛋白和mRNA水平上對大鼠肌腱細(xì)胞I型膠原的形成起著抑制作用。 體內(nèi)動物實驗，術(shù)后2、4、8周組，生物力學(xué)檢測每組實驗趾的肌腱滑移距離和關(guān)節(jié)總屈曲度明顯大于對照趾，其差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。大體觀察，實驗趾的粘連程度明顯小于對照