人核心蛋白聚糖真核載體構(gòu)建及其體內(nèi)外抑瘤作用研究.pdf

1、核心蛋白聚糖(decorin，DCN)為蛋白聚糖(proteoglycan，PG)的一種，是一種多效性分子。在調(diào)節(jié)細胞粘附、遷徙、增殖、膠原纖維形成及調(diào)節(jié)TGF-β活性中起重要作用，因而可抗組織纖維化及抑制腫瘤生長。人DCN(human decorin，hDCN)基因外顯子序列長1080bp，編碼395個氨基酸。 目的:建立hDCN的pcDNA3.1(+)真核表達載體，通過脂質(zhì)體將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入腫瘤細胞后，用流式細胞儀檢測腫瘤細

2、胞的凋亡指數(shù)，同時在小鼠體內(nèi)進行DCN抑瘤實驗的初步研究。 方法: 1.用PCR法擴增出hDCN分子編碼序列的cDNA全長，與pcDNA3.1(+)載體連接，構(gòu)建真核表達載體pcDNA3.1(+)-DCN，并轉(zhuǎn)入DH5α進行測序鑒定；2.將序列正確的pcDNA3.1(+)-DCN大量純化擴增后，通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)入小鼠腫瘤細胞S180中，然后用不同濃度的G418篩選陽性克隆細胞，提取陽性克隆細胞的RNA，并進行RT-PCR鑒定；

3、3.用流式細胞儀對轉(zhuǎn)染了重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-DCN、空質(zhì)粒pcDNA3.1(+)的S180細胞和未轉(zhuǎn)染的S180細胞進行細胞凋亡檢測和細胞周期分析；4.分別注射等量的pcDNA3.1(+)-DCN/S180、pcDNA3.1(+)/S180和S180細胞到隨機分組的小鼠腋部皮下，觀察三組小鼠的腫瘤生長情況；5.處死三組小鼠后，分別剝離腫瘤組織做病理切片鑒定。 結(jié)果: 1.擴增出的hDCN片段測序的結(jié)果，與GenBan

4、k中的DCN基因序列相比，序列完全一致，無突變；2.構(gòu)建了重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-DCN，通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將其轉(zhuǎn)入S180細胞后，篩選出抗高濃度(900μg/ml)G418的陽性克隆，并用RT-PCR法進行鑒定；3.流式細胞儀檢測轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-DCN的S180細胞凋亡率明顯高于轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)的S180細胞和未轉(zhuǎn)染的S180細胞，且其G<,0>/G<,1>期細胞百分率明顯高于后兩組，G<,2>/M期和S期

5、細胞百分率明顯低于后兩組，三組間差異存在統(tǒng)計學意義(P<0.05)；4.大量培養(yǎng)轉(zhuǎn)染陽性克隆細胞，將其注入小鼠體內(nèi)，同時選擇未轉(zhuǎn)染的S180細胞和轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)的S180細胞注入小鼠作為對照組，結(jié)果顯示注射pcDNA3.1(+)-DCN/S180的小鼠腫瘤生長明顯慢于注射S180和pcDNA3.1(+)/S180的小鼠，三組間差異存在統(tǒng)計學意義(P·<0.05)；5.三組病理切片均可見腫瘤細胞增殖，且pcDNA3.1(+)-