重組人核心蛋白聚糖對(duì)白血病K562細(xì)胞體外影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、本文對(duì)重組人核心蛋白聚糖對(duì)白血病K562細(xì)胞體外影響進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)研究。本研究分為兩個(gè)部分：
　　 第一部分：重組人核心蛋白聚糖對(duì)K562細(xì)胞增殖及凋亡作用的實(shí)驗(yàn)研究。
　　 目的：觀察重組人核心蛋白聚糖(rhDCN)對(duì)白血病K562細(xì)胞生長(zhǎng)抑制、凋亡的影響，并探討可能的作用機(jī)制。
　　 方法：⑴將已構(gòu)建好的pcDNA3.1(+)-DCN真核表達(dá)載體經(jīng)EcoRI、NotI雙酶切、測(cè)序鑒定。⑵鑒定正確的重組質(zhì)粒大量純化

2、擴(kuò)增后，通過(guò)LipofectamineTm2000脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的白血病K562細(xì)胞，提取轉(zhuǎn)染后48h細(xì)胞的總RNA，并進(jìn)行RT-PCR鑒定。⑶試驗(yàn)分為0.9％NaCl溶液組、pcDNA3.1(+)/K562組、pcDNA3.1(+)-DCN/K562組和脂質(zhì)體組。⑷經(jīng)瑞特染色觀察轉(zhuǎn)染后細(xì)胞形態(tài)的改變，MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性，碘化丙啶(PI)染色，流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期及凋亡。5.Western blot檢測(cè)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白

3、BCL-XL、Mcl-1及Bax的表達(dá)。
　　 結(jié)果：①重組質(zhì)粒雙酶切后，所得基因片斷與預(yù)期基因片斷大小相符；測(cè)序結(jié)果與Genebank中的DCN基因序列完全相符，無(wú)突變。②通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將pcDNA3.1(+)-DCN重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入K562細(xì)胞后，RT-PCR結(jié)果證實(shí)轉(zhuǎn)染成功。③pcDNA3.1(+)-DCN/K562組瑞特染色呈現(xiàn)典型的凋亡形態(tài)學(xué)改變，其他各組無(wú)明顯凋亡形態(tài)學(xué)改變。④MTT結(jié)果顯示，pcDNA3.1(+)-D

4、CN/K562組細(xì)胞增殖抑制率(轉(zhuǎn)染24h為16±1.08％，轉(zhuǎn)染48h為14±1.01％，轉(zhuǎn)染72h為20±1.19％)明顯高于對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)其他組增殖抑制率，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；FCM檢測(cè)結(jié)果顯示，pcDNA3.1(+)-DCN/K562組凋亡率(20.15±1.31％)、細(xì)胞的G0/G1期細(xì)胞百分率(51.15±0.57％)與其他各組結(jié)果比較增加明顯，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。⑤Western blot結(jié)果顯示p

5、cDNA3.1(+)-DCN/K562組與其他各組比較BCL-XL、Mcl-1蛋白表達(dá)減低，Bax蛋白表達(dá)升高。
　　 結(jié)論：rhDCN重組質(zhì)?？捎行б种芀562細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)其凋亡。rhDCN對(duì)細(xì)胞周期及凋亡相關(guān)蛋白BCL-XL、Mcl-1、Bax的影響可能是其發(fā)揮作用的機(jī)制，為白血病生物治療提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 第二部分：重組人核心蛋白聚糖基因增強(qiáng)多柔比星對(duì)K562細(xì)胞作用的實(shí)驗(yàn)研究
　　 目的：研究

6、重組人核心蛋白聚糖(rhDCN)聯(lián)合多柔比星(ADM)對(duì)白血病K562細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，并分析其可能機(jī)制。
　　 方法：用含10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液體外培養(yǎng)K562細(xì)胞，經(jīng)脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的K562細(xì)胞，試驗(yàn)分為0.9％NaCl溶液組、pcDNA3.1(+)-DCN/K562組、ADM/K562組、pcDNA3.1(+)-DCN加ADM/K562組。瑞特染色觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變；采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性；流

7、式細(xì)胞術(shù)(FCM)Annexinv/PI雙染色，分析細(xì)胞凋亡；采用RT-PCR法分析各處理組K562細(xì)胞TGF-β1 mRNA水平表達(dá)的變化。
　　 結(jié)果：pcDNA3.1(+)-DCN加ADM/K562組細(xì)胞比單獨(dú)DCN和ADM組細(xì)胞，染色呈現(xiàn)更顯著的凋亡形態(tài)學(xué)改變；MTT結(jié)果顯示聯(lián)合組細(xì)胞增殖抑制率(61±1.32％)明顯高于單獨(dú)干預(yù)組(DCN組20±1.9％；ADM組47±1.04％)(P＜0.05)，F(xiàn)CM檢測(cè)結(jié)果顯示聯(lián)