IC162抑制CML細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)CML細(xì)胞凋亡和化療增敏作用及其機制研究.pdf

1、慢性粒細(xì)胞白血病(Chtonic myeloid leukemia，CML)是以費城染色體(Philadephia，Ph)為特征的多潛能造血干細(xì)胞惡性克隆性疾病，其惡性克隆的持續(xù)擴充與細(xì)胞增殖和凋亡速率不平衡有關(guān)。CML具有特征性的染色體異位t(9，22)(q34，q11)，產(chǎn)生Bcr/abl融合基因，編碼蛋白質(zhì)P210，后者在CML的發(fā)病過程中有重要作用。研究表明，P210可促進白血病細(xì)胞增殖，延緩其凋亡。對CML的治療，傳統(tǒng)方法包括

2、羥基脲、a-干擾素、異基因造血干細(xì)胞移植及新近的酪氨酸激酶抑制劑，盡管治療效果有很大改觀，但仍有某些局限，特別是CML急變后治療效果很差。因此，尋找CML急變后的新治療方法仍是當(dāng)前CML研究的目標(biāo)。 近年來，采用傳統(tǒng)中藥提取物探討對白血病治療的新途徑引起了人們的關(guān)注，從傳統(tǒng)中藥提取的抗白血病藥物如苦參堿(Matrine)、姜黃素(Curcumin)和冬凌草甲素(Oridonin)的體外試驗表明可抑制多種白血病細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋

3、亡，動物實驗顯示該類藥物幾乎無不良反應(yīng)。新近上海交通大學(xué)附屬瑞金醫(yī)院血研所的研究顯示冬凌草甲素在體內(nèi)外能誘導(dǎo)具有t(8，21)的急性粒細(xì)胞白血病M2型(AML-M2)細(xì)胞株和原代細(xì)胞凋亡，而且副作用小，是一種潛在的抗白血病藥物。因此篩選新型抗白血病的中藥有效成分，確定其抗白血病的作用并探討其機制，已成為當(dāng)今白血病研究領(lǐng)域的熱點。 K562細(xì)胞株系人CML急性變細(xì)胞株，既具有急性白血病的細(xì)胞生物學(xué)行為，又具有CML細(xì)胞特有的本質(zhì)

4、，因此是體外研究篩選抗白血病藥物療效及機制的良好細(xì)胞模型。IC162是由單一中草藥提純出的單一化合物，分子量為368；具有類植物雌激素樣作用(由于商業(yè)機密原因，其具體成份尚未解密)，為了確定IC162是否有抗白血病效應(yīng)，本研究用IC162作用于K562細(xì)胞株及來自CML急粒變病人新鮮骨髓白血病細(xì)胞，觀察IC162對K562細(xì)胞和CML急粒變病人原代白血病細(xì)胞是否具有抑制增殖、誘導(dǎo)凋亡和化療增敏作用；并對其分子機制進行探討。 第一

5、部分 IC162對CML細(xì)胞的增殖抑制效應(yīng) 目的：觀察不同濃度IC162對K562細(xì)胞和CML急粒變病人原代白血病細(xì)胞增殖以及細(xì)胞分裂周期的影響。 方法：用臺盼藍(lán)拒染試驗、MTT試驗、集落形成抑制試驗和流式細(xì)胞儀分析K562細(xì)胞增殖能力及DNA含量，觀察不同濃度的IC162對CML細(xì)胞(K562細(xì)胞或CML急粒變病人原代白血病細(xì)胞)增殖的抑制率、集落形成和對細(xì)胞周期的影響。 結(jié)果：(1)IC162以濃度依賴性方式

6、有效地抑制CML細(xì)胞增殖，IC162抑制K562細(xì)胞活力的IC50值為8.2μmol/L；IC162抑制CML急粒變病人原代白血病細(xì)胞活力的IC50值為12.5～16.3μmol/L；(2)IC162能顯著抑制K562細(xì)胞集落形成，并呈量效關(guān)系；(3)IC162增加G0/G1期K562細(xì)胞百分率，降低S期K562細(xì)胞百分率。 結(jié)論：IC162能夠有效地抑制CML細(xì)胞增殖，并呈藥物濃度和時間依賴性，IC162可阻滯CML細(xì)胞在G0

7、/G1期從而抑制CML細(xì)胞增殖。 第二部分 IC162對CML細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)效應(yīng) 目的：確定IC162能否誘導(dǎo)CML細(xì)胞凋亡。 方法：用不同濃度的IC162作用于K562和CML急粒變病人原代白血病細(xì)胞，采用Hoctlest33258染色和AnnexinV-FITC/PI染色檢測凋亡細(xì)胞的百分率；用Western印跡檢測IC162干預(yù)后的K562細(xì)胞Caspase-3蛋白質(zhì)表達(dá)。 結(jié)果：(1)兩種檢測方法

8、均證明IC162能以濃度依賴性方式誘導(dǎo)CML細(xì)胞凋亡；(2)IC162誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡伴有Caspase-3蛋白表達(dá)上調(diào)和裂解激活。 結(jié)論：IC162能以濃度依賴性方式誘導(dǎo)CML細(xì)胞凋亡；其誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡的分子機制與Caspase-3蛋白表達(dá)上調(diào)和裂解激活有關(guān)。 第三部分 IC162對柔紅霉素和高三尖杉酯堿抗K562細(xì)胞作用的化療增敏效應(yīng) 目的：確定IC162對柔紅霉素或高三尖杉酯堿的抗K562細(xì)胞增殖

9、作用和凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)是否存在增敏效應(yīng)。 方法：用低劑量IC162(2μmol/L)分別與柔紅霉素或高三尖杉酯堿合用干預(yù)K562細(xì)胞48小時，用MTT試驗、AnnexinV-FITC/PI染色流式分析單藥或聯(lián)合用藥對K562細(xì)胞增殖、早期凋亡的影響。 結(jié)果：2μmol/L IC162分別與320μg/L柔紅霉素或40μg/L高三尖杉酯堿共同干預(yù)K562細(xì)胞，與單用低劑量的IC162、單用柔紅霉素或高三尖杉酯堿比較，聯(lián)合用藥抑

10、制K562細(xì)胞增殖活力和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡效應(yīng)更明顯。 結(jié)論：IC162對柔紅霉素或高三尖杉酯堿抗K562細(xì)胞增殖和凋亡誘導(dǎo)具有增敏效應(yīng)。 第四部分 IC162對K562細(xì)胞增殖抑制和凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)的分子機制 目的：觀察IC162作用下K562細(xì)胞增殖抑制和凋亡誘導(dǎo)過程中COX-2，Survivin，CyclinD2，CyclinE、p27，MMP-2，MMP-9和VEGF mRNA表達(dá)變化以及COX-2蛋白表達(dá)的影響，

11、以部分揭示IC162抗白血病作用的分子機制。 方法：(1)用Western blot分析IC162作用下K562細(xì)胞COX-2蛋白質(zhì)表達(dá)水平；(2)Real-time PCR定量檢測COX-2、Survivin、CyclinD2、CyclinE、p27、MMP-2、MMP-9和VEGF mRNA的表達(dá)量。 結(jié)果：(1)IC162能以濃度依賴性方式抑制K562細(xì)胞COX-2和SurvivinmRNA以及COX-2蛋白的表達(dá)