核因子-κB對(duì)人眼小梁細(xì)胞生長(zhǎng)及分泌功能影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景及目的： 小梁細(xì)胞位于前房角的小梁網(wǎng)組織中，含有多種細(xì)胞因子受體，能分泌基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)及細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)等多種成分，是維持小梁網(wǎng)結(jié)構(gòu)及功能，保持房水外引流通暢的重要因素。小梁細(xì)胞功能障礙可導(dǎo)致房水外流阻力增大，眼壓升高引發(fā)青光眼。研究發(fā)現(xiàn)原發(fā)性開(kāi)角型青光眼患者的小梁細(xì)胞數(shù)量明顯低于正常人，小梁網(wǎng)組織中ECM含量增加。因此，深入研究調(diào)節(jié)小梁細(xì)胞增殖、凋亡和分泌功能的分子機(jī)制，對(duì)明確青光眼的發(fā)病機(jī)制以及指導(dǎo)青光眼的

2、治療具有重要的意義。 NF-κB是一個(gè)廣泛存在于細(xì)胞中具有多向調(diào)節(jié)作用的核轉(zhuǎn)錄因子，在細(xì)胞生長(zhǎng)分化、增殖、凋亡、免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)等生理及病理過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。NF-κB的活化是炎癥反應(yīng)的中心環(huán)節(jié)，NF-κB的過(guò)度活化與許多急慢性炎性相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在青光眼的發(fā)生、發(fā)展及臨床治療過(guò)程中，時(shí)常伴有炎癥的發(fā)生，尤其是在外傷、葡萄膜炎所致的繼發(fā)性青光眼的發(fā)病過(guò)程中，前房炎癥反應(yīng)所產(chǎn)生的大量炎癥介質(zhì)及細(xì)胞因子，必然會(huì)

3、刺激小梁細(xì)胞NF-κB的活化。壓力應(yīng)激反應(yīng)可導(dǎo)致細(xì)胞NF-κB的活化，研究發(fā)現(xiàn)原發(fā)性青光眼小梁網(wǎng)NF-κB的表達(dá)也明顯高于正常人，而NF-κB的活化對(duì)青光眼的進(jìn)程將會(huì)產(chǎn)生何種影響，目前仍不清楚。 NF-κB的活化對(duì)細(xì)胞生存至關(guān)重要，NF-κB可通過(guò)直接調(diào)控與細(xì)胞增殖相關(guān)基因及抗凋亡基因的表達(dá)，參與細(xì)胞增殖與凋亡的調(diào)控。此外，NF-κB還可以調(diào)控多種基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)。臨床上長(zhǎng)期應(yīng)用糖皮質(zhì)激素可導(dǎo)致繼發(fā)性青光眼的發(fā)生，而糖皮質(zhì)激

4、素是NF-κB的拮抗劑，長(zhǎng)期應(yīng)用激素使NF-κB活性被過(guò)度抑制，繼而引發(fā)小梁細(xì)胞的凋亡是否是激素性青光眼的發(fā)病機(jī)制，目前亦尚不清楚。 為此，本研究擬以NF-κB為切入點(diǎn)，通過(guò)培養(yǎng)人眼小梁細(xì)胞，將NF-κB的活性亞基P65/RelA基因轉(zhuǎn)染入小梁細(xì)胞，觀察NF-κB在小梁細(xì)胞中的過(guò)度表達(dá)對(duì)小梁細(xì)胞的增殖、凋亡，以及基質(zhì)金屬蛋白酶和TIGR基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)的影響。另一方面，采用圈套策略，即應(yīng)用與NF-κB順式作用元件序列同源的寡核苷酸

5、序列抑制小梁細(xì)胞NF-κB的活化，觀察其對(duì)小梁細(xì)胞增殖、凋亡，以及基質(zhì)金屬蛋白酶和TIGR基因的表達(dá)變化的影響。本課題試圖闡述NF-κB在小梁細(xì)胞功能障礙中的作用，了解NF-κB在不同活性情況下對(duì)小梁細(xì)胞的影響，討論其與青光眼發(fā)生的可能性。 材料方法： 人眼小梁細(xì)胞原代培養(yǎng)及鑒定：利用角膜移植術(shù)的供體眼組織，應(yīng)用組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)小梁細(xì)胞，采用免疫組化SP法，進(jìn)行纖維連接蛋白(FN)、層粘連蛋白(LN)、Ⅳ型膠原、TIGR

6、蛋白及Ⅷ因子相關(guān)抗原鑒定。 細(xì)胞分組：采用培養(yǎng)在三到五代的小梁細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，隨機(jī)分為5組，正常對(duì)照組(C)，空質(zhì)粒對(duì)照組(P65-C)，P65質(zhì)粒組(P65)，隨機(jī)圈套對(duì)照組(ODN-C)，NF-κB圈套核苷酸組(ODN)P65質(zhì)粒及NF-κB圈套核苷酸細(xì)胞轉(zhuǎn)染：采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法，利用熒光顯微鏡及WesternBolt法檢測(cè)轉(zhuǎn)染效果。 P65質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后小梁細(xì)胞培養(yǎng)液TNF-α含量檢測(cè)：轉(zhuǎn)染后24小時(shí)用ELISA法檢測(cè)細(xì)

7、胞培養(yǎng)液中TNF-α的含量。 NF-κB對(duì)小梁細(xì)胞增殖及凋亡的影響：分別應(yīng)用MTT及3H-TdR摻入實(shí)驗(yàn)檢測(cè)小梁細(xì)胞的增殖情況，用Tunel法檢測(cè)小梁細(xì)胞的凋亡。 NF-κB對(duì)小梁細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)及其抑制劑(TIMlP)表達(dá)的影響：應(yīng)用RT-PCR方法檢測(cè)小梁細(xì)胞MMP-1，MMP-2，MMP-3及TIMP-1，TIMP-2mRNA的表達(dá)情況。 NF-κB對(duì)小梁細(xì)胞TIGR基因表達(dá)調(diào)控的影響：應(yīng)用RT

8、-PCR及WesternBlot法分別檢測(cè)TIGR基因mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)。 結(jié)果： 人眼小梁細(xì)胞培養(yǎng)成功，免疫組化鑒定LN、FN、Ⅳ型膠原及TIGR基因表達(dá)為陽(yáng)性，Ⅷ因子相關(guān)抗原為陰性。 P65質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，小梁細(xì)胞P65的表達(dá)明顯升高，細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α含量顯著升高。 P65高表達(dá)抑制小梁細(xì)胞的增殖及DNA合成，促進(jìn)小梁細(xì)胞凋亡增加。NF-κB圈套核苷酸同樣抑制小梁細(xì)胞的增殖及DNA合成

9、，并且促進(jìn)小梁細(xì)胞凋亡的增加。 P65高表達(dá)促進(jìn)小梁細(xì)胞MMP-1及MMP-3mRNA的表達(dá)，對(duì)MMP-2及TIMP-1，TIMP-2的表達(dá)無(wú)影響。NF-κB圈套核苷酸抑制小梁細(xì)胞MMP-1及MMP-3mRNA的表達(dá)，對(duì)MMP-2及TIMP-1，TIMP-2的表達(dá)無(wú)影響。 P65高表達(dá)抑制小梁細(xì)胞TIGR基因mRNA及蛋白質(zhì)的表達(dá)，NF-κB圈套核苷酸促進(jìn)小梁細(xì)胞TIGR基因mRNA及蛋白質(zhì)的表達(dá)。 結(jié)論：

10、 P65促進(jìn)小梁細(xì)胞分泌炎癥介質(zhì)TNF-α，提示NF-κB過(guò)度活化可引發(fā)小梁細(xì)胞出現(xiàn)過(guò)度炎癥反應(yīng)。 P65在小梁細(xì)胞中的過(guò)度表達(dá)抑制小梁細(xì)胞的增殖及DNA合成，并且促進(jìn)小梁細(xì)胞凋亡的發(fā)生。提示前房過(guò)度炎癥反應(yīng)可能影響小梁細(xì)胞的存活，炎癥繼發(fā)性青光眼的發(fā)生可能與NF-κB過(guò)度活化密切相關(guān)。 NF-κB圈套核苷酸抑制小梁細(xì)胞的增殖及DNA合成，并且促進(jìn)小梁細(xì)胞凋亡的發(fā)生，說(shuō)明NF-κB在正常情況下具有維持小梁細(xì)胞數(shù)量及功能

11、平衡的作用。提示NF-κB活性過(guò)度受抑可能是糖皮質(zhì)激素性青光眼的發(fā)生機(jī)制之一。 NF-κB活化可促進(jìn)小梁細(xì)胞MMP-1及MMP-3的表達(dá)，抑制NF-κB的活化則會(huì)抑制小梁細(xì)胞MMP-1及MMP-3的表達(dá)，說(shuō)明NF-κB在調(diào)控小粱網(wǎng)細(xì)胞外基質(zhì)平衡機(jī)制中占有重要的地位。提示長(zhǎng)期應(yīng)用NF-κB抑制劑，可能會(huì)導(dǎo)致小梁細(xì)胞MMP-1及MMP-3的分泌下降，造成小梁網(wǎng)ECM的過(guò)度堆積。 NF-κB的活化和抑制可促使小梁細(xì)胞TIGR基