脂肪細(xì)胞的新分泌蛋白PAMM對(duì)巨噬細(xì)胞炎性因子表達(dá)的調(diào)控作用研究.pdf

1、脂肪組織中的炎癥反應(yīng)與肥胖相關(guān)性代謝綜合癥密切相關(guān)，而巨噬細(xì)胞則在調(diào)節(jié)脂肪組織的炎癥反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。由于脂肪組織具有活躍的分泌功能，推測(cè)該組織可分泌蛋白來(lái)調(diào)控巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥。我們結(jié)合基因表達(dá)譜和生物信息學(xué)技術(shù)來(lái)研究前脂肪細(xì)胞（3T3-L1細(xì)胞）的分化過(guò)程，分別對(duì)前脂肪細(xì)胞（3T3-L1細(xì)胞）和成熟脂肪細(xì)胞進(jìn)行了全基因組微陣列篩選，搜索在成熟脂肪細(xì)胞中的被誘導(dǎo)高表達(dá)的基因，并進(jìn)行基因測(cè)序分析、預(yù)測(cè)信號(hào)肽以及編碼蛋白，從而發(fā)現(xiàn)了巨噬

2、細(xì)胞集落刺激因子誘導(dǎo)單核細(xì)胞活化的似過(guò)氧化物酶2（Peroxiredoxin(PRX)-like2 activated in M-CSF stimulated monocytes，PAMM），PAMM是一個(gè)具有CXXC序列的含有類似過(guò)氧化物酶2結(jié)構(gòu)域的蛋白，是一種新的分泌蛋白并具有強(qiáng)大的抗炎特性。
　　PAMM是由成熟的人脂肪細(xì)胞分泌的蛋白。PAMM在白色和棕色脂肪組織中均高表達(dá)，并在肥胖狀態(tài)時(shí)進(jìn)一步表達(dá)增加。PAMM的過(guò)表達(dá)可明

3、顯抑制脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥。用培養(yǎng)了脂肪細(xì)胞的培養(yǎng)液和抗PAMM的抗體孵育巨噬細(xì)胞，可顯著增強(qiáng)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞的炎性細(xì)胞因子的表達(dá)。此外，用提純的PAMM蛋白孵育RAW264.7細(xì)胞也有類似的抗炎作用。而且，在RAW264.7細(xì)胞中強(qiáng)制性過(guò)表達(dá)PAMM可導(dǎo)致LPS誘導(dǎo)的 ERK1/2，p38MAPK和JNK的磷酸化的減少，這表明PAMM很可能是通過(guò)抑制MAPK信號(hào)通路從

4、而發(fā)揮其抗炎的功能。失去抗氧化還原活性的PAMM CXXC結(jié)構(gòu)的突變體仍可抑制LPS刺激的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子的能力，這表明PAMM的抗炎特性可能并不依賴于其抗氧化特性。
　　第一部分、PAMM是來(lái)源于脂肪細(xì)胞的新型分泌蛋白
　　目的：搜索在成熟脂肪細(xì)胞中的被誘導(dǎo)高表達(dá)的基因、預(yù)測(cè)信號(hào)肽并編碼蛋白，確定PAMM是一種來(lái)源于脂肪細(xì)胞的分泌蛋白。
　　方法：①3T3-L1細(xì)胞與DMI（地塞米松，甲基黃嘌呤，和胰島素）孵

5、育15天誘導(dǎo)分化為脂肪細(xì)胞。細(xì)胞用油紅O染色進(jìn)行分析，并采用Nikon顯微鏡系統(tǒng)拍攝細(xì)胞染色圖像。對(duì)未分化的3T3-L1細(xì)胞以及脂肪細(xì)胞進(jìn)行微陣列分析來(lái)比較基因表達(dá)譜并進(jìn)行相關(guān)的基因測(cè)序分析。DMI誘導(dǎo)3T3-L1細(xì)胞分化期間，用Northern blot和酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)及培養(yǎng)液中PAMM的表達(dá)。②分別用Flag-PAMM質(zhì)?；騀lag-MCP

6、IP1質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，并進(jìn)行Western blot檢測(cè)，分析全細(xì)胞裂解液和培養(yǎng)基中的Flag-PAMM和 Fl+ag-MCPIP1。③Northern blot分析小鼠組織中PAMM mRNA的表達(dá)。給一個(gè)月月齡的野生型C57/BL6小鼠飼喂高脂飲食四個(gè)月，收集高脂飲食喂養(yǎng)不同時(shí)間后小鼠的白色脂肪組織，進(jìn)行Northern blot分析。
　　結(jié)果：①3T3-L1細(xì)胞與地塞米松、甲基黃嘌呤、胰島素的混合分化液（DM

7、I）孵育后，能分化成為脂肪細(xì)胞。PAMM在脂肪細(xì)胞和在3T3-L1細(xì)胞中的表達(dá)相比上調(diào)8倍，核苷酸序列分析結(jié)果表明，PAMM包含一個(gè)開(kāi)放閱讀框，編碼229個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。其蛋白質(zhì)序列與過(guò)氧化物酶家族（Peroxiredoxins，Prxs）相似，并含有一個(gè)CXXC結(jié)構(gòu)。3T3-L1細(xì)胞分化15天時(shí)細(xì)胞裂解液和培養(yǎng)液中PAMM水平均明顯上調(diào)（P＜0.05）。②Flag-PAMM和Flag-MCPIP1都出現(xiàn)在轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞全細(xì)胞

8、裂解液中，但只有flag-PAMM出現(xiàn)在培養(yǎng)基中。③PAMM mRNA在小鼠組織中廣泛表達(dá)，但在脂肪組織中的表達(dá)最高。在小鼠高脂飲食誘導(dǎo)肥胖的過(guò)程中，肥胖小鼠的脂肪組織中PAMM mRNA的顯著增加
　　小結(jié)：①PAMM是一個(gè)具有CXXC序列的含有類似過(guò)氧化物還原酶2結(jié)構(gòu)域的蛋白，3T3-L1前脂肪細(xì)胞的分化促進(jìn)PAMM表達(dá)的上調(diào)。②PAMM是一個(gè)來(lái)源于脂肪細(xì)胞的新發(fā)現(xiàn)的分泌蛋白。③PAMM在小鼠白色和棕色脂肪組織中均高表達(dá)，并在

9、肥胖小鼠的脂肪組織中進(jìn)一步表達(dá)增加。
　　第二部分、PAMM顯著抑制巨噬細(xì)胞炎性因子的表達(dá)及機(jī)制研究
　　目的：觀察PAMM對(duì)LPS誘導(dǎo)的Raw264.7巨噬細(xì)胞炎性因子表達(dá)的影響，并探討其機(jī)制。
　　方法：①Flag-PAMM質(zhì)?；?qū)φ召|(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞24小時(shí)，收集細(xì)胞裂解物進(jìn)行Western blot檢測(cè)；以磷酸鹽緩沖液（Phosphate-buffered saline，PBS）或0.1μg/ml

10、 LPS處理轉(zhuǎn)染后的RAW264.7細(xì)胞8小時(shí)，采用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（Real-time Quantitative PCR，qPCR）法檢測(cè)RAW264.7細(xì)胞的炎性細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1 beta，IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、白細(xì)胞介素-12（interleukin-12，IL-12）和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synt

11、hase，iNOS）的表達(dá)。②DMI孵育3T3-L1細(xì)胞15天，使之分化成脂肪細(xì)胞；收集分化好的3T3-L1脂肪細(xì)胞的裂解液及其細(xì)胞培養(yǎng)液，進(jìn)行western blot分析。在上述實(shí)驗(yàn)獲得的培養(yǎng)液中加入抗PAMM抗體（1.0ng/ml）或IgG預(yù)孵育1小時(shí)后，再孵育Raw264.7細(xì)胞1小時(shí)，然后用PBS或0.1μg/ml LPS處理8小時(shí)，采用qPCR法檢測(cè)IL-1β、IL-6、IL-12和iNOS mRNA的表達(dá)水平。③Akata

12、wash法提純BL21大腸桿菌中PAMM蛋白。用0、0.1、0.5μg/ml純化的PAMM蛋白孵育RAW264.7細(xì)胞30分鐘，再用0.1μg/ml LPS刺激8小時(shí)。qPCR檢測(cè)細(xì)胞IL-1β、IL-6、IL-12和iNOS mRNA的表達(dá)水平。④PAMM表達(dá)質(zhì)?；?qū)φ召|(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞24小時(shí)，用0.1μg/ml的LPS處理0，15和60分鐘。Western blot檢測(cè)細(xì)胞裂解物中細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2(extra

13、cellular signal-regulated kinases,ERK1/2)、p38絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinases,JNKs)和IκB激酶β（Inhibit kappa B kinase beta，IKKβ）的總蛋白水平及磷酸化的情況。⑤PAMM表達(dá)質(zhì)粒或PAMM C88G突變體（在CXXC結(jié)

14、構(gòu)的88位置上的半胱氨酸殘基被甘氨酸取代）的表達(dá)質(zhì)粒或?qū)φ召|(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞24小時(shí)，用PBS或400μM過(guò)氧化氫處理2小時(shí)，測(cè)定細(xì)胞胞漿中還原型谷胱甘肽（reduced glutathione，GSH）/氧化型谷胱甘肽（oxidized glutathione，GSSG）的比值。用PBS或0.1μg/ml的LPS處理上述轉(zhuǎn)染細(xì)胞8小時(shí)，qPCR法檢測(cè)細(xì)胞IL-6、IL-8和iNOS mRNA的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：

15、①RAW264.7細(xì)胞被成功轉(zhuǎn)染并過(guò)表達(dá)PAMM后，能顯著減少由LPS誘導(dǎo)的炎性因子IL-1β、IL-6，IL-12和iNOS mRNA的表達(dá)（P＜0.001）。②在分化好的脂肪細(xì)胞的裂解液及其細(xì)胞培養(yǎng)液中均有PAMM蛋白的表達(dá)，而培養(yǎng)液中的PAMM的作用被抗PAMM抗體中和后，LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞IL-1β、IL-6、IL-12和iNOS mRNA的表達(dá)顯著增加（P<0.001）。③提純的PAMM蛋白能劑量依賴性地抑制LP

16、S刺激的RAW264.7細(xì)胞的IL-1β、IL-6、IL-12和iNOS mRNA的表達(dá)（P<0.001）。④過(guò)表達(dá)PAMM顯著抑制LPS誘導(dǎo)的Raw264.7細(xì)胞的 ERK1/2，p38MAPK和 JNK的磷酸化，而對(duì)LPS誘導(dǎo)的Raw264.7細(xì)胞的IKKβ的磷酸化則無(wú)抑制作用。⑤與過(guò)表達(dá)PAMM C88G突變體相比較，過(guò)表達(dá)PAMM則可顯著阻止由H2O2所導(dǎo)致的GSH/GSSG比值的降低（P<0.001）。過(guò)表達(dá)PAMM和過(guò)表達(dá)P

17、AMM C88G均可顯著抑制LPS誘導(dǎo)的IL-6和IL-8的表達(dá)（P<0.001）。但與過(guò)表達(dá)PAMM不同，過(guò)表達(dá)PAMM C88G未顯著抑制LPS誘導(dǎo)的iNOS的表達(dá)。
　　小結(jié)：①PAMM對(duì)巨噬細(xì)胞炎性因子的表達(dá)具有顯著的抑制作用。②過(guò)表達(dá)PAMM顯著抑制LPS誘導(dǎo)的Raw264.7細(xì)胞的ERK1/2，p38MAPK和JNK的磷酸化，提示PAMM抑制LPS刺激的巨噬細(xì)胞的MAPK信號(hào)通路。③PAMM具有抗氧化應(yīng)激的能力，提示P

18、AMM是一個(gè)具有氧化還原功能的調(diào)節(jié)蛋白，它的CXXC結(jié)構(gòu)對(duì)其抗氧化的能力是至關(guān)重要；PAMM抑制LPS刺激的巨噬細(xì)胞炎性細(xì)胞因子生產(chǎn)的能力與其抗氧化性能無(wú)關(guān)。
　　結(jié)論
　　1.PAMM是一個(gè)具有CXXC序列的含有類似過(guò)氧化物還原酶2結(jié)構(gòu)域的氧化還原調(diào)節(jié)蛋白，是一種新型的脂肪細(xì)胞分泌蛋白；
　　2.PAMM抑制 LPS刺激的巨噬細(xì)胞炎性因子的表達(dá)與其抑制MAPK（ERK、P38MAPK、JNK）的活性有關(guān)，與其抗氧化性