卵巢癌特異性結合肽的篩選及其對卵巢癌生物學行為的影響.pdf

1、目的與背景:
　　卵巢癌病死率居女性生殖器三大惡性腫瘤首位，在確診時75％的患者已是FIGOIII期以上病變。發(fā)生遠處轉移、侵潤和化療耐藥性是卵巢癌高病死率、預后差的關鍵因素。因此，臨床上迫切需要探索卵巢癌治療及其轉移、復發(fā)干預治療的新方法。近年來，靶向藥物輸送系統(tǒng)治療卵巢癌備受關注，但始終沒有找到高特異性、高親和力的載體。噬菌體展示技術通過確定表達在不同腫瘤細胞或組織器官上特異性分子的結合肽，并以此結合肽為載體與藥物靶向相聯，可

2、以有效地提高定向傳遞化療藥物的能力。目前國內尚未見卵巢癌特異性結合肽的研究報道。因此，本實驗擬使用噬菌體展示文庫技術首次篩選卵巢癌細胞特異性結合肽，并通過體內外實驗研究其對卵巢癌侵襲和轉移生物行為的影響，為卵巢癌的靶向治療提供理想的載體。
　　方法:
　　1.利用改良的細胞培養(yǎng)方法分離培養(yǎng)正常卵巢上皮細胞，創(chuàng)新性地運用細胞刷刷取人卵巢表面上皮（human ovarian surface epithelium，HOSE），紅細

3、胞裂解法、差速貼壁法對細胞進行分離純化，并向無血清DMEM-F12培養(yǎng)基中添加人表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）進行細胞培養(yǎng)。在倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，HE染色和免疫細胞化學染色法對細胞進行鑒定，為后續(xù)的篩選試驗提供理想的體外試驗材料。
　　2.以人卵巢癌細胞HO8910為靶細胞，分離獲取的人正常卵巢上皮細胞為吸附細胞，對噬菌體隨機環(huán)七肽庫進行四輪差減篩選；細胞酶聯免疫吸附法（ELISA法）

4、驗證陽性噬菌體克?。粚Λ@得的陽性克隆進行DNA測序及生物信息學分析,并進一步利用免疫熒光實驗,鑒定噬菌體陽性克?。╬hage1）與HO8910細胞的特異性結合，為針對人卵巢癌不同位點的靶向藥物設計提供實驗依據。
　　3.鑒定獲取的噬菌體陽性克隆序列后，合成該特異性短肽序列（命名為peptide1），設立卵巢癌HO8910-k1組（peptide1組）、HO8910-k15組（control組）及HO8910組（blank組），通過

5、細胞生長曲線、Transwell體外遷移和重組基底膜侵襲實驗、粘附實驗研究特異性短肽對HO8910細胞株侵襲和轉移能力，探討特異性合成短肽（peptide1）對卵巢癌體外惡性生物學行為的影響。
　　4.建立特異性短肽結合HO8910細胞裸鼠腹腔移植瘤模型，計算抑瘤率，免疫組化計算血管內皮生長因子(vascularendothelial growth factor，VEGF)的表達和原位凋亡TUNEL法檢測腫瘤細胞凋亡指數（apop

6、totic index，AI），進一步探討特異性合成短肽K1（peptide1）對卵巢癌體內惡性生物學行為的影響。
　　結果:
　　1.卵巢表面上皮培養(yǎng)24小時開始貼壁生長，7~12天后基本達到融合，細胞呈多角形或扁平型，透光性及折光性強。細胞形態(tài)符合正常上皮細胞特性，所分離的細胞幾乎完全表達上皮細胞表面標志物CK19。細胞生長良好，可以傳6~8代，細胞生長曲線呈“S”形，純度達95%以上。細胞刷取培養(yǎng)法操作簡單，能夠快速分

7、離獲得大量卵巢表面上皮，所獲得的細胞經紅細胞裂解法和差速貼壁法處理后純的達到95%以上，且細胞生長穩(wěn)定，為組織工程研究提供了充足的種子細胞。
　　2.經過四輪篩選后，噬菌體在靶細胞HO8910上出現了明顯的富集現象，第4輪篩選后與第1輪相比,富集了244倍；ELISA對20個隨即挑選的克隆進行鑒定，12個可與HO8910特異性結合；DNA測序后得到一段與卵巢癌細胞特異性結合的七肽SWQIGGN（命名為K1），免疫熒光檢測顯示表達S

8、WQIGGN序列的噬菌體克?。╬hage1）能夠與HO8910細胞結合，細胞呈綠色熒光反應，并不與人正常卵巢上皮細胞結合，提示phage1能與HO8910細胞特異結合。
　　3.合成并純化后的的K1，細胞生長曲線顯示K1組HO8910細胞自第三天開始生長速度明顯慢于其它兩組，P＜0.05，差異具有統(tǒng)計學意義。粘附實驗和細胞體外遷移侵襲實驗表明合成的特異性短肽K1（SWQIGGN）能明顯抑制HO8910PM的侵襲和轉移能力，與對照組

9、相比P＜0.05，差異具有統(tǒng)計學意義。表明特異性短肽K1（SWQIGGN）能夠在體外抑制卵巢癌HO8910細胞的生長、侵襲及轉移。
　　4.腫瘤侵襲轉移體內實驗表明特異性短肽K1（SWQIGGN）組裸鼠生長速度明顯受到抑制、腫瘤體積、質量及播散數目均減少，與對照組及空白組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.5），而對照組與空白組相比，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.5）。表明SWQIGGN肽能夠抑制HO8910細胞的增長，并能夠在體內抑制

10、卵巢癌HO8910細胞的惡性生物學行為。
　　結論:
　　1.運用細胞刷取法成功培養(yǎng)出人卵巢表面上皮，該方法不僅簡便，而且高效實用，為卵巢癌的基礎和臨床研究提供了理想的試驗材料。
　　2.采用BRASIL噬菌體展示技術和全細胞差減篩選策略，篩選出卵巢癌表面分子特異性的結合短肽SWQIGGN，為卵巢癌的靶向治療提供了可能的作用靶向結合位點。
　　3.SWQIGGN短肽能夠促進卵巢癌細胞的體內外生長、侵襲及轉移能力。