Livin在卵巢癌中的表達(dá)及其基因沉默對(duì)卵巢癌細(xì)胞生長(zhǎng)和化療敏感性的影響.pdf

1、目的： 卵巢原發(fā)性惡性腫瘤中，60％～90％是上皮性癌。腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)和以鉑類為基礎(chǔ)的化療是上皮性卵巢癌的主要治療原則。但隨之而來(lái)的腫瘤細(xì)胞耐藥問(wèn)題使相當(dāng)一部分患者在手術(shù)和化療后仍會(huì)出現(xiàn)疾病進(jìn)展或復(fù)發(fā)，致使其5年生存率不到30％，成為病死率最高的婦科惡性腫瘤。細(xì)胞凋亡受阻不但在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用；而且也是臨床上腫瘤化療失敗的重要原因，成為惡性腫瘤的標(biāo)志。不斷理解腫瘤細(xì)胞凋亡阻滯的調(diào)節(jié)機(jī)制，通過(guò)特異性干擾腫瘤細(xì)胞中抗凋

2、亡因子的作用，有望為腫瘤治療新策略的建立提供基礎(chǔ)。 凋亡抑制蛋白(Inhibitor of apoptosis proteins，IAPs)家族由一類結(jié)構(gòu)相關(guān)的抗凋亡蛋白組成，Livin是新近發(fā)現(xiàn)的一員。研究表明，Livin基因異常表達(dá)，通過(guò)調(diào)節(jié)半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶(caspases)-3、-7和-9可抵抗多種凋亡前體誘導(dǎo)的凋亡。Livin在多數(shù)惡性腫瘤如黑色素瘤及宮頸癌中表達(dá)，而在人體的大多數(shù)正常組織中不表達(dá)或低表達(dá)，提示

3、Livin可能和其它凋亡抑制蛋白一樣通過(guò)抵抗凋亡而參與了腫瘤的發(fā)生。降低或消除Livin基因在腫瘤細(xì)胞中的過(guò)度表達(dá)，可解除Livin對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡的抑制作用，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞死亡和增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，可能為腫瘤的治療提供有意義的新方法。 RNA干擾(RNA interference，RNAi)是指內(nèi)源性或外源性與靶基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA存在同源互補(bǔ)序列的雙鏈RNA，在細(xì)胞內(nèi)特異地降解該mRNA，從而致使特異性的基因有效封

4、閉的過(guò)程，是一種序列特異性的轉(zhuǎn)錄后基因沉默。RNAi作為近年來(lái)新出現(xiàn)的技術(shù)以其簡(jiǎn)單快速、特異、高效、經(jīng)濟(jì)等特點(diǎn)顯示出良好的應(yīng)用前景。利用RNAi技術(shù)研究Livin基因在卵巢癌中的作用在國(guó)內(nèi)、外未見(jiàn)報(bào)道。 本研究利用RNAi技術(shù)研究Livin基因沉默后卵巢癌細(xì)胞增殖及凋亡的變化及對(duì)順鉑化療敏感性的變化，以逐步增加對(duì)其在卵巢癌發(fā)生、發(fā)展中作用的認(rèn)識(shí)，并藉此探討卵巢癌基因治療的方法和途徑。本論文共分三部分。第一部分，題目：Livin及

5、SMAC在上皮性卵巢癌中的表達(dá)及意義。目的：檢測(cè)Livin及SMAC在上皮性卵巢癌組織中的表達(dá)，探討Livin、SMAC與上皮性卵巢癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系。第二部分，題目：靶向Livin-shRNA重組慢病毒載體的構(gòu)建及鑒定。目的：構(gòu)建靶向Livin-shRNA重組慢病毒載體，為進(jìn)一步研究Livin功能奠定基礎(chǔ)，提供實(shí)驗(yàn)工具。第三部分，題目：Livin基因沉默對(duì)卵巢癌SKOV-3生物學(xué)功能及化療敏感性影響的實(shí)驗(yàn)研究。目的：研究特異性siRN

6、A重組慢病毒感染卵巢癌細(xì)胞SKOV-3，基因沉默后，卵巢癌細(xì)胞的增殖和凋亡的變化及對(duì)順鉑化療敏感性的影響。 方法： 第一部分 利用RT-PCR和免疫印記(Western blotting)技術(shù)，檢測(cè)20例正常卵巢組織、20例卵巢良性上皮性腫瘤和50例卵巢惡性上皮性腫瘤組織中Livin基因mRNA和蛋白的表達(dá)情況；利用免疫組化技術(shù)檢測(cè)上述組織中Livin和SMAC的表達(dá)情況，并分析各自與上皮性卵巢癌臨床病理參數(shù)的關(guān)

7、系。 第二部分 設(shè)計(jì)并合成4個(gè)靶向Livin的短發(fā)夾狀siRNA靶序列，克隆入慢病毒表達(dá)質(zhì)粒pGCL-GFP；以含有Livin基因的質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增Livin基因cDNA序列，克隆入真核表達(dá)載體pdsRED2-N1-3FAG；將構(gòu)建好的Livin基因過(guò)表達(dá)質(zhì)粒和不同靶點(diǎn)的RNAi慢病毒表達(dá)質(zhì)粒，經(jīng)lipfectamine2000包裹，共轉(zhuǎn)染入人293T細(xì)胞，Western blot和熒光顯微鏡檢測(cè)Livin蛋白的表達(dá)情況

8、，篩選干擾效率最高者包裝成重組慢病毒；感染卵巢癌細(xì)胞SKOV-3后，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)Livin mRNA的變化。 第三部分 特異性SiRNA重組慢病毒、非特異性陰性對(duì)照慢病毒感染卵巢癌SKOV-3細(xì)胞。MTT法檢測(cè)細(xì)胞的增殖情況，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡，Western blot檢測(cè)Caspase-3的活性。再將細(xì)胞暴露于低濃度順鉑，MTT法檢測(cè)細(xì)胞的增殖情況，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡，Western blot檢測(cè)Ca

9、spase-3的活性。 結(jié)果： 第一部分 Livin在正常組織中陽(yáng)性率為10％，在良性卵巢腫瘤組織中陽(yáng)性率為15％，在惡性卵巢腫瘤組織中陽(yáng)性率為64％，三組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。兩種異構(gòu)體同時(shí)表達(dá)，表達(dá)量基本相同，蛋白水平與mRNA水平一致。Lvin在卵巢惡性腫瘤中的表達(dá)明顯高于其在正常卵巢組織和卵巢良性腫瘤組織中的表達(dá)。在上皮性卵巢癌組織中，Livin的表達(dá)與組織病理學(xué)分級(jí)成正相關(guān)，與分期無(wú)關(guān)；

10、SMAC與組織病理學(xué)分級(jí)、分期成負(fù)相關(guān)，表達(dá)出現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì)。 第二部分 挑選陽(yáng)性重組克隆，經(jīng)測(cè)序完全正確，成功構(gòu)建針對(duì)Livin基因4個(gè)RNAi質(zhì)粒和1個(gè)過(guò)表達(dá)質(zhì)粒。共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后，2個(gè)有效靶點(diǎn)對(duì)Livin蛋白的表達(dá)敲減分別為75％和80％，并呈劑量依賴性。293T細(xì)胞包裝出的慢病毒滴度為3×108TU/ml。慢病毒感染SKOV-3后，LivinmRNA的表達(dá)下降7096，其最佳感染MOI為20。 第三

11、部分 MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞的吸光度值，特異性干涉組與非特異性干涉及空白對(duì)照組比較，在72h和96h時(shí)間點(diǎn)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。流式細(xì)胞儀分析LiVinsiRNA對(duì)細(xì)胞干涉后72h的凋亡的影響顯示，特異性干涉組細(xì)胞凋亡率為與非特異性干涉組、空白對(duì)照組的3倍(P<0.01)，非特異性干涉組與空白對(duì)照組比較沒(méi)有明顯差異。Western blot檢測(cè)到特異性干涉組Caspase-3激活，而非特異性干涉組與空白對(duì)照組比較沒(méi)有明

12、顯差異。暴露于順鉑后，聯(lián)合用藥組細(xì)胞的凋亡率明顯增加，細(xì)胞增殖更加緩慢，Caspase-3激活顯著升高。 結(jié)論： 第一部分 Livin基因mRNA和蛋白表達(dá)升高和SMAC蛋白表達(dá)降低在上皮性卵巢癌的發(fā)生、分化過(guò)程中起重要作用。Livin基因有可能成為治療卵巢癌的靶標(biāo)之一。 第二部分 特異性siRNA可明顯抑制SKOV-3細(xì)胞中Livin基因的表達(dá)，并呈劑量和時(shí)間依賴性。成功構(gòu)建了能高效抑制Livi