Pim-3在卵巢癌中的表達及其過表達對卵巢癌SKOV3細胞影響的實驗研究.pdf

1、近年研究發(fā)現(xiàn)Pim-3可抑制凋亡，促進細胞增殖并影響細胞周期，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，成為腫瘤研究中一個全新的熱點，對Pim-3功能的深入研究將使目前對腫瘤發(fā)生發(fā)展調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的認識帶來革命性的變化。Pim-3在肝癌、結(jié)腸癌、胃癌等多種腫瘤存在異常表達，并與腫瘤的的發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移潛能及術(shù)后復(fù)發(fā)有關(guān)。同是Pim家族的Pim-1在上皮性卵巢癌中高表達并發(fā)揮抗凋亡作用，但Pim-3在卵巢癌中的表達及其在卵巢癌發(fā)生、發(fā)展中的作用尚有待于

2、進一步研究。
　　目的:
　　1.檢測Pim-3基因在卵巢癌組織、良性卵巢腫瘤組織及正常卵巢組織中的表達差異，探討Pim-3表達量與卵巢癌臨床病理因素之間的關(guān)系;
　　2.構(gòu)建Pim-3過表達慢病毒真核表達載體，轉(zhuǎn)導(dǎo)入人卵巢癌細胞株SKOV3中，篩選獲得Pim-3過表達單克隆細胞株;
　　3.探討過表達Pim-3后卵巢癌細胞SKOV3增殖、遷移及凋亡等生物學(xué)行為的改變。
　　方法:
　　1.Trizo

3、l法提取26例卵巢癌、25例卵巢良性腫瘤及16例正常卵巢組織標(biāo)本的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用實時熒光定量PCR（Realtime-PCR）方法，檢測各標(biāo)本組織中Pim-3的表達量，比較三組之間的表達差異，分析Pim-3基因的表達量與卵巢癌臨床病理特征的關(guān)系。
　　2.采用RT-PCR方法，自人卵巢癌SKOV3細胞中提取總RNA，特異性擴增Pim-3片段，將擴增產(chǎn)物克隆至pMD19-T simple載體，雙內(nèi)切酶切下粘性末端，

4、克隆至慢病毒表達載體pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP上，測序鑒定挑選構(gòu)建成功的重組慢病毒真核表達載體;將陽性重組質(zhì)粒及空白質(zhì)粒導(dǎo)入病毒包裝細胞293T中;收集病毒上清液轉(zhuǎn)染SKOV3細胞，熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染情況，選用單細胞有限稀釋法篩選單克隆細胞株，應(yīng)用實時熒光定量PCR及Western Blot法分別鑒定Pim-3mRNA及其蛋白水平的表達量。
　　3.建立過表達Pim-3的SKOV3卵巢癌細胞株后，應(yīng)用CCK8

5、法檢測細胞增殖能力;劃痕實驗檢測腫瘤細胞遷移能力;流式細胞術(shù)檢測卵巢癌細胞的凋亡。
　　結(jié)果:
　　1.Pim-3mRNA在正常卵巢組織、良性卵巢腫瘤組織及卵巢癌組中的表達量分別為:2.88±4.57、0.065±0.040及0.028±0.015，Pim-3在卵巢癌組織中的表達量顯著高于良性卵巢腫瘤組及正常卵巢組，差異均有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)，良性腫瘤組與正常組之間無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。卵巢癌組織中的Pim-

6、3基因表達量與年齡(P=0.53)、有無腹腔積液(P=0.07)無關(guān)(P＞0.05)，與臨床分期(P=0.02)、病理分級(P=0.03)及有無轉(zhuǎn)移(P=0.03)有關(guān)(P＜0.05)。
　　2.經(jīng)pMD19-T simple載體和pCDH載體克隆、酶切鑒定及序列分析后，證實人Pim-3過表達重組慢病毒真核表達載體構(gòu)建成功。感染pCHD-Pim-3重組質(zhì)粒及pCDH空載體的293T細胞生產(chǎn)的病毒上清分別感染SKOV3細胞，在熒光顯

7、微下觀察到帶綠色熒光的SKOV3細胞，應(yīng)用單細胞有限稀釋法獲得單克隆細胞株，實時熒光定量PCR及Western Blot鑒定顯示感染重組質(zhì)粒的SKOV3細胞中Pim-3mRNA及蛋白表達水平均高于空載體細胞，Pim-3過表達細胞株建立成功。
　　3.經(jīng)CCK8試劑盒檢測24小時、48小時及72小時后重組質(zhì)粒組OD450值分別為0.53±0.07、2.17±0.03及3.67±0.25，pCDH空質(zhì)粒組分別為0.44±0.03，1.

8、53±0.03及2.64±0.40，與空載體轉(zhuǎn)染的SKOV3細胞相比，過表達Pim-3可促進SKOV3細胞增殖(P＜0.05);空白細胞組、空載體對照組及重組質(zhì)粒組24小時細胞遷移距離分別為3.21±0.23mm、3.14±0.17mm、4.00±0.33mm，過表達Pim-3后細胞遷移能力增強(P＜0.05);流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)過表達Pim-3后SKOV3細胞的凋亡率較pCDH組及空白細胞組減少(P＜0.05)。
　　結(jié)論:

9、r>　　1.Pim-3mRNA在卵巢癌組中的表達量高于卵巢良性腫瘤組及正常卵巢組，差異均有統(tǒng)計學(xué)差異，良性腫瘤組與正常組之間無統(tǒng)計學(xué)差異。卵巢癌組織中的Pim-3基因表達量與年齡、有無腹腔積液無關(guān)，與臨床分期、病理分級及有無轉(zhuǎn)移有關(guān)。
　　2.成功構(gòu)建了人Pim-3過表達慢病毒真核表達載體pCDH-Pim-3，轉(zhuǎn)染SKOV3細胞后，篩選獲得Pim-3過表達的SKOV3卵巢癌單克隆細胞，Pim-3mRNA及蛋白表達水平均上調(diào)。