遺傳性異常纖維蛋白原血癥家系基因型及功能分析.pdf

1、目的：
　　纖維蛋白原(fibrinogen，F(xiàn)IB)是機體豐度最高的凝血因子，在凝血酶作用下轉(zhuǎn)變成為纖維蛋白，發(fā)揮其生理功能。一方面，纖維蛋白可以相互交聯(lián)，和血細胞及其他凝血因子共同聚集，參與止血過程;另一方面，纖維蛋白的形成又可以纖溶系統(tǒng)的激活，防止血栓形成。因此，作為共同凝血途徑中重要的凝血因子，纖維蛋白原在機體維持出血與止血平衡中發(fā)揮重要作用。遺傳性異常纖維蛋白原血癥(inherited dysfibrinogenemia

2、)是一種罕見的常染色體雜合顯性遺傳病，小部分為純合顯性遺傳。遺傳性異常纖維蛋白原血癥發(fā)病率低并且患者癥狀輕微較隱匿，F(xiàn)IB基因復(fù)雜，需要從分子發(fā)病機制上才能得出完整診斷。本研究對1例純合突變的遺傳性異常纖維蛋白原血癥患者及家系成員進行表型及基因分析，并從功能上加以分析，共同探討其相關(guān)的分子發(fā)病機制。
　　方法：
　　（一）、研究對象
　　1.家系資料:先證者，男，57歲，籍貫浙江杭州，因“消瘦半年”就診，實驗室檢查發(fā)現(xiàn)

3、凝血酶原時間(prothrombin time，PT)及凝血酶時間(thrombin time，TT)延長，活化部分凝血活酶時間(activated partialthromboplastin time，APTT)正常，纖維蛋白原活性明顯降低。平素無自發(fā)出血或血栓病史，肝、腎功能正常。該家系共有4代19人，無近親婚配史，其他成員均無自發(fā)出血或血栓病史，其女兒有習(xí)慣性流產(chǎn)史。
　　2.正常對照者:我院健康體檢者100例，男性60名，

4、女性40名，平均35(23-56)歲。對照組采樣前均取得知情同意，且經(jīng)查實均無肝腎功能疾病，無出血或血栓性疾病史。
　?。ǘ?、研究方法
　　1.樣本收集及處理
　　在知情同意的情況下，采集患者、家系成員及對照組體檢者靜脈血，以0.109mol/L枸櫞酸鈉1∶9抗凝，4℃1500g離心15min，分裝血漿于-80℃低溫保存。抽提外周血細胞基因組脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)，-80℃

5、保存?zhèn)溆谩?br>　　2.凝血指標檢測
　　使用Sysmex CA-7000全自動凝血分析儀，采用凝固法測定FIB活性及PT、APTT、TT,免疫濁度法測定血漿D-二聚體(D-Dimer);使用SIEMENS BN-Ⅱ蛋白分析儀采用免疫散射比濁法測定FIB抗原含量。所有操作均按照試劑說明書進行。
　　3.家系基因分析
　　根據(jù)FIB基因序列（GenBank FGB ID:2244 FGA ID:2243 FGG ID:

6、2266），應(yīng)用Primer Premier5.0軟件，設(shè)計23對引物以覆蓋FIB基因的24個外顯子區(qū)域及其啟動子序列。在Genepro TC-E DNA擴增儀進行聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chainreaction，PCR)，PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5％瓊脂糖凝膠電泳條帶鑒定，將不同批次PCR產(chǎn)物分別送上海英濰捷基公司和廣州華大基因公司正反向測序。用Genetyx軟件將測序結(jié)果與美國國立生物信息中心(National Centerf

7、or Biotechnology Information，NCBI)中的FIB基因序列（GenBank FGB ID:2244 FGA ID:2243 FGG ID:2266）進行比對(Blast)，找尋基因突變位點;使用Chromas軟件查看突變位點的峰圖，確定突變性質(zhì)。
　　4.纖維蛋白原突變體檢測
　　將先證者家系所有成員枸櫞酸鈉抗凝外周血血漿用磷酸鹽緩沖液(Phosphate-Buffered Saline，PBS)

8、1∶200倍稀釋，血漿加入上樣樣緩沖液后100℃加熱變性5 min，經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（Sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）（5％濃縮膠，8％分離膠）分離后，100 V恒壓2h，濕轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯(Polyvinylidene Fluoride，PVDF)膜。牛血清白蛋白（Albumin from bovine serum，B

9、SA）室溫封閉2h，一抗用兔抗人纖維蛋白原多抗室溫孵育2h，二抗用辣根過氧化物酶(horse radish peroxidase，HRP)標記的羊抗兔IgG抗體室溫孵育1h。電化學(xué)發(fā)光法(Electro Chemical Luminescence，ECL)檢測FIB蛋白，將顯影條帶與健康對照人群FIB條帶比對，判斷該家系是否存在FIB突變體。
　　5.纖維蛋白原功能檢測
　　采用美國Haemoscope TEG5000血栓彈

10、力圖儀，按照儀器操作說明及試劑說明書，將先證者家系所有成員的枸櫞酸鈉抗凝外周血進行血栓彈力圖(thromboelastogram，TEG)檢測，分析其凝血功能。
　　6.異常纖維蛋白原結(jié)構(gòu)與功能預(yù)測
　　使用NCBI開放閱讀框?qū)ふ夜ぞ?Open Reading Frame Finder，ORF Finder)對纖維蛋白原野生型和突變型序列進行在線分析，并根據(jù)兩個分析結(jié)果分別作后續(xù)表達產(chǎn)物（氨基酸）序列一級、二級及空間結(jié)構(gòu)分析

11、預(yù)測。最后將野生型序列提交蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（Protein Data Bank，PDB），對比分析纖維蛋白原的三維空間結(jié)構(gòu)，對其結(jié)構(gòu)功能進行預(yù)測。
　　結(jié)果：
　　1.凝血指標檢測
　　先證者APTT、D-Dimer均正常，PT和TT顯著延長，纖維蛋白原活性檢測較低（Cluass法），抗原含量（免疫散射比濁）檢測在正常范圍內(nèi)。先證者母親、妹妹、弟弟、女兒凝血指標與先證者相似，PT和TT延長，纖維蛋白原活性有不同程度減低，家

12、系其他成員及健康對照凝血指標均正常。
　　2.家系基因型檢測
　　先證者FGG第8外顯子上g.1001 A＞C(p.Asn308Thr)純合突變，導(dǎo)致γ鏈第308位天冬酰胺（asparagine，Asn）突變?yōu)樘K氨酸(threonine，Thr)。家系中，先證者弟弟該位點也為純合突變，但是先證者母親、妹妹和女兒在該位點為雜合突變，家系其他人在此位點上無突變。
　　3.纖維蛋白原突變體檢測
　　對先證者家系成員血漿

13、進行免疫印跡檢測，與健康人群混合血漿條帶Aα、Bβ、γ鏈比較未發(fā)現(xiàn)纖維蛋白原突變體。
　　4.纖維蛋白原功能檢測
　　與健康對照相比，先證者母親、妹妹和女兒TEG均呈現(xiàn)類似的低角度，最大振幅正常的血栓彈力圖，提示其血小板功能正常，纖維蛋白原功能降低。然而先證者及Ⅱ-3血栓彈力圖均呈現(xiàn)更低的角度，最大振幅正常，提示更為嚴重的纖維蛋白原功能降低，血小板功能正常。家系其他成員血栓彈力圖均正常。
　　5.纖維蛋白原突變體蛋白結(jié)

14、構(gòu)與功能預(yù)測
　　突變位點γ鏈308Asn位于纖維蛋白原交聯(lián)的結(jié)合界面處，對于纖維蛋白原聚合為纖維蛋白具有重要作用。Asn308Thr的突變影響了纖維蛋白結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，導(dǎo)致家系突變成員TT、PT延長及凝血共同途徑受損。
　　結(jié)論：
　　1.該遺傳性纖維蛋白原血癥家系先證者纖維蛋白原FGGγ鏈第8外顯子存在顯性純合型錯義突變Asn308Thr，推測先證者父親該位點為雜合突變。
　　2.Asn308Thr多態(tài)性與該家