調(diào)控食管鱗癌細(xì)胞CAR的表達(dá)對溶瘤腺病毒H101抗癌作用影響.pdf

1、背景和目的
　　 我國食管癌的發(fā)病率居全世界之首,由于食管癌本身具有進(jìn)展快、侵襲性強(qiáng)等特點(diǎn),大多數(shù)患者被發(fā)現(xiàn)時已處于中晚期,傳統(tǒng)手術(shù)加化療、放療的治療方案效果不佳,需要進(jìn)一步尋找新的治療方法。H101病毒是以人類C組5型腺病毒(adenovirus,Ad)為基礎(chǔ),利用基因重組技術(shù)得到的一種刪除了E1B-55KD和E3區(qū)片段的溶瘤腺病毒,使病毒相對選擇性的在腫瘤細(xì)胞中復(fù)制。在臨床試驗(yàn)中聯(lián)合化療,H101已經(jīng)取得了令人鼓舞的療效。但

2、是,臨床試驗(yàn)表明作為單一制劑療效不理想,并且在不同腫瘤中使用效果存在顯著差異。
　　 單獨(dú)應(yīng)用H101效果不佳和腫瘤細(xì)胞表達(dá)柯薩奇-腺病毒受體(coxsackievirus-adenovirus receptor,CAR)水平密切相關(guān)。以5型Ad為基礎(chǔ)構(gòu)建的H101病毒有效感染腫瘤細(xì)胞,需要通過細(xì)胞表面CAR受體黏附和通過整合素家族的整合素αⅴβ3和αⅴβ5的內(nèi)化。腫瘤細(xì)胞表面CAR作為腺病毒感染的第一受體完成病毒-細(xì)胞的識別,

3、CAR表達(dá)水平?jīng)Q定了靶細(xì)胞對腺病毒(adenovirus,Ad)的感染效率。研究顯示許多腫瘤細(xì)胞如卵巢癌、肺癌、乳腺癌及膀胱癌等CAR的表達(dá)降低甚至缺乏。
　　 有資料表明CAR表達(dá)轉(zhuǎn)錄調(diào)控是通過乙?；揎椫厮芎诵◇w調(diào)節(jié)進(jìn)行的,組蛋白去乙?；敢种苿?histone deacetylase inhibitor,HDACi),通過抑制組蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase,HDACs)的活性來提高CAR基因的表達(dá)

4、,從而使腫瘤細(xì)胞表面CAR受體表達(dá)增加,但是HDACi通過何種信號通路影響哪些分子從而改變細(xì)胞中CAR基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯,至今尚未見報道。曲古菌素A(trichostatin A,TSA)是一種強(qiáng)大的組蛋白去乙?；敢种苿?研究發(fā)現(xiàn)TSA能使一些腫瘤細(xì)胞如乳腺癌、肺癌、卵巢癌中CAR表達(dá)上調(diào)表達(dá),對食管鱗癌CAR的表達(dá)的影響未見報道。
　　 目前關(guān)于食管鱗癌細(xì)胞CAR的表達(dá)情況及其與溶瘤腺病毒H101的抗癌效果的關(guān)系并不清楚,本研

5、究首先以食管鱗癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)細(xì)胞系EC9706、ECl為研究對象,分析食管鱗癌細(xì)胞EC9706、ECl中CAR的表達(dá)情況以及H101病毒對二者的抗腫瘤效應(yīng),然后利用TSA來干擾腫瘤細(xì)胞CAR的表達(dá),觀察食管鱗癌細(xì)胞表面CAR表達(dá)變化后溶腫瘤腺病毒的抗腫瘤效果,并探索其通過影響MAPK/ERK1/2信號通路對CAR表達(dá)影響的機(jī)制,同時探討TSA對溶瘤腺病毒H101抗食管

6、鱗癌ECl細(xì)胞裸鼠移植瘤的作用影響,為進(jìn)一步提高H101臨床治療食管癌效果奠定基礎(chǔ)。
　　 第一部分CAR在食管鱗癌細(xì)胞中的表達(dá)及對H101病毒的抗腫瘤效果的研究
　　 方法：
　　 采用RT-PCR檢測Hela、EC9706、ECl細(xì)胞系CAR mRNA水平；間接免疫熒光標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞表面CAR的表達(dá)陽性率；采用免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測、免疫熒光法和Western Blotting檢測細(xì)胞CAR蛋白表達(dá)；以M

7、OI=1 H101分別感染細(xì)胞株細(xì)胞后,以TCDIS0的方法檢測48小時測后病毒的增殖倍數(shù),通過病毒增殖實(shí)驗(yàn)檢測H101病毒在細(xì)胞的增殖倍數(shù),采用MTS實(shí)驗(yàn)檢測H101對腫瘤細(xì)胞增殖抑制作用。
　　 結(jié)果：
　　 1.食管鱗癌細(xì)胞EC9706、ECl細(xì)胞的CAR mRNA相對表達(dá)量分別為0.98±0.07、0.75±0.07,明顯低于陽性對照細(xì)胞Hela細(xì)胞CAR mRNA相對表達(dá)量1.73±0.08(P<0.01)。<

8、br>　　 2.流式細(xì)胞術(shù)檢測三株細(xì)胞CAR的表達(dá),EC9706、ECl細(xì)胞表面CAR表達(dá)陽性率分別為21.00±2.00％和9.67±3.05％,明顯低于Hela的CAR表達(dá)陽性率74.67±9.45％(P<0.01),并且ECl細(xì)胞表面CAR表達(dá)明顯低于EC9706細(xì)胞CAR表達(dá)(P<0.05)。
　　 3.免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示,在三株細(xì)胞的細(xì)胞膜上均有棕黃色顆粒,和陽性對照Hela細(xì)胞相比,食管鱗癌EC9706、ECl細(xì)

9、胞CAR的表達(dá)明顯弱于Hela細(xì)胞。免疫熒光細(xì)胞化學(xué)檢測結(jié)果EC9706、ECl細(xì)胞表面綠色熒光顆粒明顯弱于Hela細(xì)胞。Western blotting結(jié)果顯示,EC9706、ECl細(xì)胞CAR蛋白相對表達(dá)量為明顯低于Hela細(xì)胞(P<0.01)。
　　 4.H101在EC9706、ECl細(xì)胞中的增殖倍數(shù)分別為538.33±69.23和240.55±19.59,明顯低于Hela細(xì)胞中的增殖倍數(shù)1825±256.72(P<0.05

10、)
　　 5.MTS實(shí)驗(yàn)檢測H101對腫瘤細(xì)胞增殖抑制作用,H101對EC9706、ECl細(xì)胞增殖抑制作用明顯弱于對Hela細(xì)胞抑制作用(P<0.05)。
　　 第二部分 TSA對食管鱗癌CAR表達(dá)的影響及其機(jī)制的研究
　　 一、TSA對食管鱗癌EC9706、ECl細(xì)胞后生物學(xué)特性的影響
　　 方法：
　　 0.1,0.3,0.5,1.0,3.0μmol/L TSA作用EC9706、ECl細(xì)胞,用

11、MTS細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)檢測TSA對細(xì)胞增殖抑制作用；0.3,0.5,1.0μmol/L TSA作用EC9706、ECl細(xì)胞,用流式細(xì)胞術(shù)檢測對細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡的影響；同時用 Westernblotting檢測TSA處理EC9706、ECl細(xì)胞后p21 WAF1/CIP1、Bax、Bcl-2表達(dá)的變化。
　　 結(jié)果：
　　 1.細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)顯示,0.5μmol/l以上濃度TSA可引起ECl細(xì)胞增殖抑制而1.0μmol/L T

12、SA以上才可抑制以EC9706細(xì)胞的增殖。
　　 2.0.3μmol/L TSA和0.5μmol/L TSA組EC9706細(xì)胞周期與對照組相比,無明顯變化(P>0.05)。1.0μmol/L TSA組G0/G1期細(xì)胞百分比顯著增加,同時S期細(xì)胞顯著減少,與對照組相比有顯著差異(P<0.05)；0.3μmol/L TSA處理ECl細(xì)胞后細(xì)胞周期與對照組相比,無明顯變化(P>0.05)。隨TSA濃度增加,G0/G1期ECl細(xì)胞百分比

13、逐漸增大,而S期細(xì)胞百分比降低,且呈濃度依賴關(guān)系(P<0.05)。
　　 3.1.0μmol/L TSA作用于EC9706細(xì)胞后細(xì)胞凋亡率明顯增加(P<0.05)；0.5μmol/L TSA以上隨著TSA濃度升高,細(xì)胞凋亡率顯著增加升高(P<0.05)。
　　 4.1.0μmol/L TSA作用EC9706細(xì)胞后P21 WAF1/CIP1蛋白、Bax蛋白表達(dá)明顯增加,而Bcl-2蛋白表達(dá)明顯減少(P<0.05)；ECl細(xì)

14、胞0.5μmol/L TSA以上濃度作用后P21 WAF1/CIP1蛋白、Bax蛋白表達(dá)明顯增加,而Bcl-2蛋白表達(dá)明顯減少(P<0.05,圖2.1.10)。
　　 二、TSA上調(diào)食管鱗癌細(xì)胞CAR表達(dá)增強(qiáng)H101病毒抗腫瘤效應(yīng)
　　 方法：
　　 以0.3,0.5,1.0μmol/L TSA作用EC9706、ECl細(xì)胞48h,采用RT-PCR檢測CAR mRNA的表達(dá)；間接免疫熒光標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞表面C

15、AR的表達(dá)陽性率；采用免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測和免疫熒光法檢、Western Blotting檢測細(xì)胞CAR蛋白表達(dá)；以MOI=1 H101分別0.3μmol/L TSA處理的ECl細(xì)胞后,以TCDI50的方法檢測48小時測后病毒的增殖倍數(shù),采用MTS實(shí)驗(yàn)檢測H101對0.3μmol/L TSA處理48h的ECl細(xì)胞后對細(xì)胞增殖抑制作用。
　　 結(jié)果：
　　 1.0.3,0.5,1.0μmol/L TSA作用EC9706細(xì)胞C

16、AR mRNA相對表達(dá)量分別為0.71±0.09、0.91±0.03和1.13±0.05,較對照組(0.53±0.04)明顯增加(P<0.05)；0.3,0.5,1.0μmol/L TSA作用ECl細(xì)胞RT-PCR檢測CAR mRNA相對表達(dá)量分別為0.67±0.03、0.77±0.03和0.89±0.06,較對照組(0.47±0.03)明顯增加(P<0.05)。
　　 2.0.3,0.5,1.0μmol/L TSA作用EC97

17、06細(xì)胞,間接免疫熒光標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞表面CAR的表達(dá)陽性率分別為29.00±0.55％、32.36±1.02％和52.48±1.25％,較對照組(19.57±1.39％)明顯增加(P<0.05);0.3,0.5,1.0μmol/LTSA作用ECl細(xì)胞CAR的表達(dá)陽性率分別為19.02±0.35％、27.77±0.65％和40.63±1.06％,較對照組(9.58±0.89％)明顯增加(P<0.05)。
　　 3.免疫細(xì)胞

18、化學(xué)法檢測、免疫熒光法和Western Blotting檢測EC9706和ECl細(xì)胞,CAR蛋白表達(dá)以劑量依賴方式增加(P<0.05)。
　　 4.0.3μmol/L TSA作用ECl細(xì)胞后H101的增殖倍數(shù)為527.46±11.70,較對照組260.75±9.64明顯增加(P<0.05)。
　　 5.H101病毒的不同滴度對0.3μmol/L TSA組作用的ECl細(xì)胞增殖抑制作用明顯高于對照組(P<0.05)。

19、　　 三、TSA上調(diào)食管鱗癌細(xì)胞CAR表達(dá)機(jī)制的探討
　　 方法：
　　 1.Western blotting檢測1.0μmol/L TSA作用1h、6h、12h、24h、48h后ECl、EC9706 p-ERK和CAR的表達(dá),分析p-ERK和CAR的相關(guān)性；
　　 2.為了研究TSA可以通過MAPK/ERK1/2信號通路影響HDAC4的磷酸化水平,1.0μmol/L TSA分別作用ECl和EC9706細(xì)胞48

20、h,用免疫共沉淀檢測p-ERK1/2和HDAC4的相互作用,免疫共沉淀產(chǎn)物用Western blotting檢測1.0μmol/L作用ECl和EC970后引起的和HDAC4作用ERK1/2的磷酸化水平的變化
　　 3.為了研究 TSA引起組蛋白H4乙?；降母淖儗AR基因啟動子活性的影響,1.0μmol/L TSA分別作用ECl和EC9706細(xì)胞48h,應(yīng)用乙?；M蛋白H4抗體進(jìn)行染色質(zhì)免疫共沉淀,根據(jù)Gene bank中C

21、AR啟動子基因序列設(shè)計上、下游引物,通過PCR擴(kuò)增鑒定乙?；M蛋白H4和CAR啟動子之間的相互作用,Western blotting檢測共沉淀產(chǎn)物中,和CAR啟動子結(jié)合的組蛋白H4乙?；降淖兓?br>　　 結(jié)果：
　　 1.TSA以時間依賴方式上調(diào)食管鱗癌細(xì)胞CAR的表達(dá)和抑制ERK1/2磷酸化,采用Pearson法雙因素相關(guān)分析顯示,1.0μmol/L TSA作用于食管鱗癌細(xì)胞引起CAR表達(dá)水平增加和p-ERK水平呈顯

22、著負(fù)相關(guān)(P<0.01)。
　　 2.免疫共沉淀反應(yīng)結(jié)果顯示1.0μmol/L TSA處理組和對照組食管鱗癌細(xì)胞中p-ERK1/2均和HDAC4之間均存在相互作用。但是1.0μmol/L TSA處理細(xì)胞后和HDAC4作用的p-ERK1/2水平較對照組降低(P<0.05)。
　　 3.以乙?；慕M蛋白H4進(jìn)行CHIP反應(yīng),PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5％瓊脂糖凝膠電泳,顯示在180bp左右有清晰的特異條帶,與設(shè)計目的基因片段一致。

23、說明乙?；M蛋白H4和CAR基因啟動子之間的相互作用,證明了乙?；慕M蛋白H4和CAR基因啟動子之間存在相互作用；1.0μmol/L TSA作用于食管鱗癌細(xì)胞后,和CAR基因啟動子的作用的乙?；M蛋白H4水平較未處理組明顯升高(P<0.05)。
　　 第三部分 TSA對溶瘤腺病毒H101抗食管鱗癌ECl細(xì)胞裸鼠移植瘤的作用影響
　　 方法：
　　 每只裸鼠皮下注射6×106食管鱗癌細(xì)胞ECI,建立食管鱗癌ECl細(xì)

24、胞皮下移植瘤模型,分為(1)PBS對照組,以PBS代替藥物瘤內(nèi)注射；(2)TSA組,0.3μmol/L的TSA200μl瘤內(nèi)注射,每3d一次；(3)H101組,在TSA組第二次注射后24h后,每只裸鼠瘤內(nèi)注射1.0×109IU/100μl H101；(4)H101+TSA組,0.3μmol/L的TSA200μl瘤內(nèi)注射,每3d一次,第二次注射TSA后24h后,每只裸鼠瘤內(nèi)注射1.0×109IU/100μl H101,治療3w后處死裸鼠,

25、觀察腫瘤體積的變化,測定各組裸鼠皮下移植瘤平均瘤重及抑瘤率;用免疫組化和Western blotting檢測各組移植瘤組織CAR的變化。
　　 結(jié)果：
　　 1.H101+TSA組和 PBS對照組、TSA組、H101組相比裸鼠移植瘤體積、移植瘤重量均明顯減少(P<0.05)；H101+TSA組對腫瘤生長抑制率為80.32％,明顯高于TSA組(2.18％)和H101組(28.42％)。
　　 2.免疫組化和West

26、ern blowing檢測ECl細(xì)胞裸鼠移植瘤組織CAR的表達(dá),TSA組和TSA+H101組CAR蛋白的表達(dá)明顯高于對照組和H101組(P<0.05),說明移植瘤瘤內(nèi)注射TSA可提高移植瘤組織的CAR水平。
　　 結(jié)論：
　　 1.食管鱗癌細(xì)胞系EC9706和ECl細(xì)胞CAR的表達(dá)水平明顯低于宮頸癌Hela細(xì)胞表面CAR的表達(dá)；食管鱗癌細(xì)胞低表達(dá)CAR,影響H101病毒溶瘤效果。
　　 2.TSA上調(diào)食管鱗癌細(xì)胞