Src介導(dǎo)PSD-95酪氨酸磷酸化的研究.pdf

1、為研究Src激酶對PSD-95蛋白的磷酸化作用，并鑒定相應(yīng)的磷酸化部位，提取鼠腦組織中的PSD-95(postsynaptic density protein 95)，并構(gòu)建PSD-95-pcDNA3.1真核表達(dá)載體，使其在哺乳動物細(xì)胞COS-7中表達(dá)，分別通過體外激酶反應(yīng)研究PSD-95是否可被Src激酶磷酸化；在COS-7細(xì)胞中分別表達(dá)PSD-95及其突變體的Myc融合蛋白：Myc-PSD-95、Myc-△G(去除PSD-95羧基端

2、GK結(jié)構(gòu)域)和Myc-△SG(去除PSD-95羧基端SH3和GK結(jié)構(gòu)域)，通過體外激酶反應(yīng)初步鑒定Src激酶介導(dǎo)下PSD-95酪氨酸磷酸化的部位 1．Sre激酶介導(dǎo)鼠腦組織中PSD-95的酪氨酸磷酸化 取大鼠海馬，制備突觸后密集區(qū)(PSD)，用抗PSD-95的抗體(anti-PSD-95)進(jìn)行免疫沉淀。免疫沉淀物在ATP存在條件下與Src激酶在30℃反應(yīng)30分鐘后，用抗磷酸酪氨酸抗體(anti-pY)免疫印跡顯示，Src

3、能介導(dǎo)PSD-95蛋白的酪氨酸磷酸化。 2．PSD-95-pcDNA3.、Myc-PSD-95-pcDNA3.1及Myc-△G-pcDNA3.1真核表達(dá)載體的構(gòu)建 采用RT-PCR法從大鼠海馬中擴(kuò)增出大鼠PSD-95的cDNA，克隆到peDNA3.1真核表達(dá)載體，經(jīng)序列測定后證明與已發(fā)表的大鼠海馬PSD-95序列完全一致。 以Myc-PSD-95-GW1(由Sheng M惠贈)為模板，利用PCR擴(kuò)增出包含特定PSD-95

4、序列的突變體Myc-△G。將Myc-PSD-95和Myc-△G基因克隆到真核表達(dá)載體pcDNA3.1中，經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切和測序結(jié)果證實擴(kuò)增出的突變型PSD-95基因亦完全正確。 3.野生型／突變型PSD-95重組質(zhì)粒在COS-7細(xì)胞中獲高效表達(dá) 經(jīng)鑒定序列完全正確的野生型／突變型PSD-95重組體用脂質(zhì)體介導(dǎo)法轉(zhuǎn)染到COS-7細(xì)胞系中。用高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24-48h，收集細(xì)胞，分別用anti-PSD-95以及an

5、ti-c-Myc抗體進(jìn)行免疫印跡分析，可見PSD-95-pcDNA3.1、Myc-PSD-95-pcDNA3.1、Myc-△G-pcDNA3.1、Myc-△SG-pcDNA3.1組均可檢測到相應(yīng)的蛋白質(zhì)條帶。結(jié)果表明，野生型和突變型PSD-95重組質(zhì)粒在COS-7細(xì)胞中均獲得了高效表達(dá)。 4.Src介導(dǎo)Myc-PSD-95及Myc-△G的酪氨酸磷酸化，對Myc-△SG沒有磷酸化作用 分別收集轉(zhuǎn)染24.48h的COS-7細(xì)

6、胞，超聲破碎后按Lowry法測定蛋白質(zhì)含量。分別用anti-PSD-95以及anti-c-Myc抗體進(jìn)行免疫沉淀，經(jīng)洗滌后收集沉淀樣品，加入ATP、Src激酶，30℃反應(yīng)30min。用anti-pY抗體免疫印跡顯示，Src能介導(dǎo)PSD-95、Myc-PSD-95以及Myc-△G的酪氨酸磷酸化，Myc-△SG沒有發(fā)生磷酸化反應(yīng)。 結(jié)論： 1.成功地克隆出野生型／突變型PSD-95真核表達(dá)重組質(zhì)粒：PSD-95-pcDNA3