PTPN12對心臟HERG鉀通道的酪氨酸磷酸化水平調控作用的研究.pdf

1、研究背景：
　　長QT綜合征(LQTS),又稱延遲復極綜合征,主要的臨床表現(xiàn)包括室性心律失常(以尖端扭轉性室性心動過速、室顫多見)、暈厥和猝死。根據(jù)病因分為先天性或遺傳性長QT綜合征,以及獲得性長QT綜合征兩大類。其中,獲得性長QT綜合征常與電解質紊亂、心動過緩、心肌缺血及某些藥物等因素相關。由于導致QT間期延長的因素眾多,和它本身所具有的潛在致命性,因此越來越受到人們的關注。根據(jù)突變基因的不同,LQTS分為12種類型,分別為LQ

2、T1至LQT12。12種LQTS的致病基因分別為:KCNQ1(LQT1)、KCNH2(LQT2)、SCN5A(LQT3)、ANK2/AnkyrinB(LQT4)、Mink/KCNE1(LQT5)、MiRP1/KCNE2(LQT6)、KCNJ2(LQT7)、CACNA1/Cav2.1(LQT8)、CAV3(LQT9)、SCN4B(LQT10)、AKAP9/Yotiao(LQT11),SNTA1(LQT12)。其中LQT2為第二常見類型,在

3、中國最常見,主要由人類果蠅相關基因(Human ether-a-go-go-related gene,HERG)的突變所致。HERG基因位于人第7對染色體7q35.36位點。HERG鉀通道電流參與構成心肌細胞動作電位3期的主要外向電流,其基因突變可導致鉀離子通道數(shù)量減少或通道功能減退,從而導致QT間期延長。在我們前期的研究中,發(fā)現(xiàn)了非受體型蛋白酪氨酸磷酸酶12(PTPN12)通過與HERG鉀通道相互作用而發(fā)揮調控HERG鉀通道電流振幅的

4、功能。本課題在既往基礎上進一步從酪氨酸磷酸化水平調控這一角度深入研究PTPN12對HERG鉀通道調控的機理。
　　目的：
　　明確PTPN12對HERG鉀通道酪氨酸磷酸化的調控作用以及該作用對HERG鉀通道電流特性的影響,為深入闡明LQTS的發(fā)病機理及開發(fā)治療該病的新型蛋白質藥物提供理論基礎及新思路。
　　方法：
　　1.應用基因定點突變技術,構建一個聯(lián)合位點突變的pCDNA3.0-HERG Y327A-Y700

5、A-Y845A質粒,然后基因測序進行驗證;
　　2.免疫共沉淀和蛋白免疫印跡技術:本研究分為4個組:
　　a.轉染pCDNA3.1-空載體和pCDNA3.0-空載體的HEK293細胞;
　　b.轉染pCDNA3.0-HERG和pCDNA3.1-空載體的HEK293細胞;
　　c.轉染pCDNA3.0-HERGY327A-Y700A-Y845A和pCDNA3.1-PTPN12的HEK293細胞;
　　d.轉染

6、pCDNA3.0-HERG和pCDNA3.1-PTPN12的HEK293細胞。
　　用RIPA蛋白裂解液提取轉染后的HEK293細胞總蛋白,取等量的細胞總蛋白,一部分直接用PTPN12抗體進行Western Blot分析;另一部分與4G10抗體混合過夜,第二天加入Protein A/G Agarose,振蕩2小時后離心沉淀,取沉淀物進行凝膠電泳,再用抗HERG抗體和4G10抗體進行Western Blot分析;
　　3.應用

7、膜片鉗技術,檢測不同實驗組中HERG鉀離子通道的電流振幅變化。
　　本研究分為4個組:
　　1.對照組(轉染pCDNA3.0-HERG細胞組);
　　2.PTPN12過表達組(共轉染pCDNA3.0-HERG和pCDNA3.1-PTPN12細胞組);
　　3.PTPN12過表達并PAO干預組(共轉染pCDNA3.0-HERG和pCDNA3.1-PTPN12,并給予磷酸酯酶抑制劑(sodium orthovanad

8、ate,PAO)處理細胞組);
　　4.PTPN12過表達并HERG突變組(共轉染pCDNA3.0-HERGY327A-Y700A-Y845A和pCDNA3.1-PTPN12,的HEK293細胞組)。
　　結果：
　　1.成功構建了HERG不同位點的聯(lián)合突變體,并經(jīng)DNA測序證明突變位點的存在;
　　2.免疫共沉淀和蛋白免疫印跡分析發(fā)現(xiàn):相對于HERG單獨轉染組,PTPN12與HERG共轉染組的HERG鉀通道酪氨

9、酸磷酸化水平下降2.2倍,PTPN12與HERG突變體共轉染組的HERG鉀通道酪氨酸磷酸化水平下降3.7倍。
　　3.膜片鉗檢測發(fā)現(xiàn),PTPN12過表達組的HERG電流振幅(204.08±17.73pA)明顯低于對照組的HERG電流振幅(399.70±29.58pA),兩組之間的電流振幅差異具有顯著性差異(P<0.010);PTPN12過表達并PAO干預組的電流振幅(414.33±26.67pA)明顯高于PTPN12過表達組的HE

10、RG電流振幅(204.08±17.73pA),兩組的電流振幅差異具有顯著性差異(P<0.010);PTPN12過表達并HERG突變組的電流振幅(374.25±22.37pA)明顯高于PTPN12過表達組的HERG電流振幅(204.08±17.73pA),兩組振幅之間的差異具有顯著性差異(P<0.010)。
　　結論：
　　1.蛋白酪氨酸磷酸酶非受體型12對心臟HERG鉀離子通道的酪氨酸殘基具有去磷酸化作用,對心臟HERG鉀通