NF-κB抑制劑在破骨細(xì)胞生成和骨吸收中的作用.pdf

1、人工關(guān)節(jié)置換術(shù)是治療各種關(guān)節(jié)疾病終末期病變最普遍而有效的方法，但隨著假體使用時(shí)間延長(zhǎng)，假體發(fā)生松動(dòng)，失敗率不斷上升。過(guò)去一般將這種假體松動(dòng)單純歸咎于假體與骨界面間的密貼欠佳、假體安裝位置不良、骨水泥碎裂等力學(xué)原因。但近年來(lái)人們認(rèn)識(shí)到：人工關(guān)節(jié)后期松動(dòng)除上述因素外，主要與假體長(zhǎng)期磨損或離解產(chǎn)生的顆粒所誘導(dǎo)的生物學(xué)反應(yīng)有關(guān)。生物學(xué)反應(yīng)過(guò)程包括：
　?、倌p顆粒的產(chǎn)生；
　?、诩袤w-骨界面間異物反應(yīng)膜的形成；
　　③破骨細(xì)胞

2、性骨溶解，導(dǎo)致假體的骨性支持結(jié)構(gòu)力學(xué)性能下降。
　　尤其是破骨細(xì)胞性骨溶解的作用被認(rèn)為意義重大。因此，研究破骨細(xì)胞性骨溶解對(duì)預(yù)防假體松動(dòng)具有十分重要的意義。
　　RANKL／RANK／NF-κB被認(rèn)為是介導(dǎo)破骨細(xì)胞分化成熟的最重要的信號(hào)通路。目前發(fā)現(xiàn)破骨細(xì)胞內(nèi)與RANKL相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路主要有四條：NF-κB通路、MAPK通路、PI3K/Akt通路和CN/NFAT通路。其中NF-KB通路被認(rèn)為是對(duì)磨損顆粒誘導(dǎo)破骨細(xì)胞激活發(fā)

3、揮最重要的作用。NF-κB抑制劑包括：PDTC(二硫代氨基甲酸吡咯烷，Pyrrolidine dithiocarbamate)，NAC（N－乙酰半胱氨酸，N-acetylcysteine）等。早期研究已證明PDTC及NAC對(duì)NF-κB激活有專一抑制作用。它們抑制NF-κB激活的機(jī)制是通過(guò)抑制I-κB（靜止細(xì)胞中在胞漿內(nèi)與NF-κB結(jié)合，阻止其進(jìn)入細(xì)胞核發(fā)揮作用）降解，使NF-κB不能轉(zhuǎn)入細(xì)胞核中與其相應(yīng)耙基因的啟動(dòng)子結(jié)合，從而不能通過(guò)啟

4、動(dòng)或調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄來(lái)調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的分化，功能。
　　本研究是采用聚甲基丙烯酸甲脂（Polymethylmethacrylate，PMMA）顆粒誘導(dǎo)的小鼠顱骨骨溶解的動(dòng)物模型體系，通過(guò)Micro-CT掃描后三維重建分析多項(xiàng)數(shù)據(jù)；HE染色、TRAP染色后進(jìn)行圖像分析，探討NF-κB抑制劑對(duì)體內(nèi)破骨細(xì)胞骨溶解功能的作用及對(duì)局部骨溶解的影響。為闡明NF-κB抑制劑對(duì)關(guān)節(jié)置換術(shù)后骨溶解的防治作用奠定新的理論基礎(chǔ)。具體內(nèi)容如下：
　　1.

5、小鼠顱骨骨溶解模型的建立：2％戊巴比妥鈉腹腔注射，麻醉后輸液膠布固定四肢及頭部，新潔爾滅酊消毒頭部皮膚，在顱骨正中矢狀縫位置切開(kāi)頭皮，切口約0.5cm長(zhǎng)，用骨刀刮除骨膜，移液管滴入PMMA顆粒懸液（30mg：0.1ml），4-0號(hào)線縫合頭部皮膚。術(shù)后小鼠籠內(nèi)自由活動(dòng)。自術(shù)后第二天起每日給予小鼠腹腔注射藥物，術(shù)后2周處死。
　　2.Micro-CT掃描后應(yīng)用eXplore MicroView分析軟件進(jìn)行三維圖像重建，并分析顱骨標(biāo)本的

6、BMC、BMD、BVF、CA、CMT五項(xiàng)數(shù)據(jù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)各項(xiàng)指標(biāo)整體趨勢(shì)大致相同。所有分析結(jié)果均表明，PDTC、NAC組比生理鹽水對(duì)照組的骨密度、骨礦含量均有明顯增高，用藥后骨骼的硬度力學(xué)性能均有相應(yīng)改善。兩藥物組BVF比對(duì)照組明顯增大，說(shuō)明骨吸收作用被抑制。CA及CMT分析也顯示藥物組皮質(zhì)骨厚度比對(duì)照組增厚，皮質(zhì)骨面積與對(duì)照組比較明顯增大。這些指標(biāo)都證明了藥物對(duì)骨吸收有明顯的抑制作用。說(shuō)明藥物對(duì)顆粒誘導(dǎo)的骨溶解有明確的抑制作用。

7、　　3.制備組織切片并染色
　　3.1、HE染色，TRAP（抗酒石酸酸性磷酸酶）染色。所有組織測(cè)量均使用OsteoMeasure Analysis System，使用顯微鏡分別放大50×，100×，拍攝圖片后進(jìn)行骨組織計(jì)量學(xué)分析。指標(biāo)包括：
　　①溶解面積百分比OA(Percentage of Osteolytic area)，OA越大表明骨溶解效應(yīng)越明顯；
　?、谄乒羌?xì)胞數(shù)目ON(Osteo-clast number

8、)，ON越大表明破骨細(xì)胞越多，引起骨溶解效應(yīng)越大。
　　結(jié)果發(fā)現(xiàn)：生理鹽水對(duì)照組OA最大，顯示骨溶解作用最明顯。NAC藥物組比PDTC藥物組OA更明顯。PBS對(duì)照組骨溶解效應(yīng)最弱。各組骨溶解面積百分比有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），t檢驗(yàn)分析兩藥物組間差異明顯（P<0.05）。說(shuō)明PDTC比NAC有更強(qiáng)的骨溶解抑制作用。生理鹽水對(duì)照組破骨細(xì)胞數(shù)目ON最多，PBS組ON最少，兩藥物組ON居中，然而經(jīng)t檢驗(yàn)比較后發(fā)現(xiàn)NAC組與PDT

9、C組間差異不顯著（P>0.05）。
　　3.2、免疫組化染色NF-κBp65表達(dá)陽(yáng)性的IOD(積分光密度)。NF-κBp65的含量越多IOD值越大。分析結(jié)果顯示：PBS對(duì)照組NF-κBp65表達(dá)最弱，生理鹽水對(duì)照組NF-κBp65表達(dá)最強(qiáng)。One-way ANOVA分析結(jié)果顯示四組IOD值之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。PDTC組比NAC組NF-κBp65表達(dá)更弱，說(shuō)明兩種藥物對(duì)NF-ΚBp65有抑制作用，而且PDTC的抑制作用