腫瘤微環(huán)境中CD4+T細胞調(diào)控及Treg細胞亞型與腫瘤相關(guān)性研究.pdf

1、研究背景:
　　 生物治療是目前腫瘤治療的熱點領(lǐng)域,不僅受到基礎(chǔ)研究領(lǐng)域的重視,更得到轉(zhuǎn)化醫(yī)學科學家及臨床醫(yī)生的關(guān)注。生物治療不僅是傳統(tǒng)治療手段的補充,更是治療觀念的更新,但其臨床應用的安全性和有效性問題,仍是制約著腫瘤生物治療發(fā)展的兩大關(guān)鍵。
　　 現(xiàn)階段處于研究前沿的一種腫瘤生物治療方法是基于T細胞的腫瘤浸潤淋巴細胞(Tumor Infiltrating Lymphocytes,TIL)過繼免疫細胞治療(Adopti

2、ve CellTherapy／Adoptive Cell transfer Treatment,ACT)。同時,腫瘤的一大生物學特征——免疫逃逸功能,也與腫瘤原位微環(huán)境中的抑制性免疫細胞密切相關(guān),如腫瘤相關(guān)巨噬細胞(Tumor Associated Macrphage,TAM),耐受性樹突狀細胞(tolerogenicDC)以及調(diào)節(jié)性T細胞(Regulatory T Lymphocyte,Treg)等。在TIL細胞中,這些抑制性免疫細胞

3、的存在,使基于T淋巴細胞的抗腫瘤細胞治療之效果和安全性受到懷疑。特別是Treg細胞,其能對提純培養(yǎng)的腫瘤殺傷性細胞產(chǎn)生干擾,并最終導致細胞治療的質(zhì)量的降低,這是學者們亟需破解的難題。
　　 Stat3基因是信號轉(zhuǎn)導子和轉(zhuǎn)錄激活子家族(Signal transducers and activators oftranscription family,Stat)的成員,是腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵信號通路JAK1／Stat3的調(diào)控因子。其在免

4、疫系統(tǒng)中同樣發(fā)揮著舉足輕重的作用,特別是對腫瘤微環(huán)境中介導免疫逃逸和免疫殺傷的平衡。與本研究密切相關(guān)的是,本研究前期發(fā)現(xiàn),在卵巢癌腫瘤微環(huán)境中提取的TIL細胞含有Th17細胞。而IL-6-Stat3-Th17軸能促進無菌性炎癥,這種“癌性炎癥”被發(fā)現(xiàn)與腫瘤發(fā)生過程密切相關(guān),此類能促進腫瘤生長的Th17細胞與幫助腫瘤實現(xiàn)免疫逃逸的Treg細胞在腫瘤微環(huán)境中同時出現(xiàn),這兩者在腫瘤微環(huán)境中的相互作用值得深入探討。
　　 Treg細胞依

5、其來源可分為自然發(fā)生Treg(natural Treg,nTreg)和誘導發(fā)生Treg(induced Treg,iTreg)細胞,那么對于Treg細胞是否還可以通過其抑制功能再進行亞型分類?腫瘤微環(huán)境中Treg細胞的亞型分類是否與其抑制功能相符?本研究在離體條件下,對Treg的細胞因子誘導分化嘗試,是立足于對現(xiàn)有細胞治療方法改進的探索。為探討Stat3基因?qū)D4+T細胞的重要性,以及在進行針對Stat3基因的靶向治療時,Stat3基

6、因在腫瘤得中到抑制的同時,微環(huán)境中正常CD4+T細胞抗腫瘤功能的會否受到影響?我們建立了CD4+T細胞特異性Stat3敲除的小鼠,對其介導的抗腫瘤免疫功能進行評估。
　　 研究目的:
　　 明確Stag基因敲除對CD4+T細胞的發(fā)育和功能的影響,特別是其激活后增殖、分化能力的變化；研究Stat3-／-CD4+T細胞在介導過繼免疫治療時能否繼續(xù)發(fā)揮正常的支持作用；分析Stat3基因敲除導致CD4+T細胞無法擴增CD8+T細

7、胞的確切機制；通過建立模式動物FoxP3gfp小鼠離體Treg細胞功能分析模型,了解Treg細胞的亞型再分的可能性；應用小鼠水平的發(fā)現(xiàn),在人體腫瘤疾病模型中求證Treg的幼稚型亞型確實存在并占據(jù)重要地位；試驗離體細胞因子誘導Treg細胞分化能力,為未來進行過繼細胞免疫治療的改進提供新思路。
　　 研究內(nèi)容:
　　 1.Stat3缺陷型CD4+T細胞介導的小鼠特異性抗黑色素瘤過繼細胞治療模型
　　 (1)CD4+T

8、細胞敲除Stat3基因的小鼠模型建立及表型分析
　　 通過Floxp-Cre重組酶系統(tǒng),我們建立了在CD4+T細胞中特異性敲除Stat3的16-21外顯子(包含SH2結(jié)構(gòu)域)的小鼠,從而分析Stat3蛋白功能失活對CD4+T細胞功能的影響。我們進行了PCR和Westernblot實驗及ELISA測定細胞因子釋放、FCM流式細胞術(shù)分析等一系列實驗。結(jié)果顯示,Stat3的敲除并不影響CD4+T細胞的發(fā)育成熟,但其TCR激活增殖能力受

9、抑,且向Th17方向的分化能力完全缺失。
　　 (2)B16小鼠黑色素瘤移植瘤模型及過繼免疫治療療效分析
　　 當我們以B16小鼠黑色素瘤接種Stat3-／-小鼠時,其抗腫瘤免疫顯示出缺陷。進一步的過繼免疫治療模型研究顯示,Stat3的敲除導致了CD4+T細胞在體內(nèi)雖然能夠被腫瘤細胞所激活,但其增殖減少而不能向CD8+殺傷性T細胞提供足夠的支持使其擴增,最終導致過繼細胞治療的失效。
　　 (3)TCR受體下游信號

10、通路與Stat3信號通路對凋亡的調(diào)控分析
　　 對于Stat3敲除所導致的CD4+T細胞增殖下降的原因我們進行了深入的探討。當我們使用泛caspase抑制劑Z-VAD-fmk時,TCR激活導致的Stat3-／-CD4+T細胞增殖受損得到了一定的恢復,故而推測此種凋亡增加的現(xiàn)象與TCR受體通路和Bcl-2凋亡通路都有關(guān)。進一步的Westernblot實驗和免疫共沉淀實驗明確了,TCR復合物通過ZAP70激酶蛋白調(diào)節(jié)Stat3磷酸化

11、激活,及下游Bcl-2家族的促凋亡蛋白上調(diào)、抑凋亡蛋白下調(diào)。
　　 2.乳腺癌腫瘤微環(huán)境中Treg細胞的亞型比例及功能的研究
　　 (1)模式動物FoxP3gfp小鼠的nTreg細胞亞型免疫抑制功能分析
　　 在我們使用FCM流式細胞術(shù)分析FoxP3gfp小鼠脾臟細胞來源的nTreg時,發(fā)現(xiàn)根據(jù)細胞表面標志分子CD62L和CD44可以將其進一步分為幼稚型和記憶型亞系。經(jīng)MACS陰性分選、FACS陽性分選,證實這兩

12、種亞型細胞是獨立的兩群細胞,能夠被高純度的提純分離。而Treg細胞免疫抑制能力試驗顯示,幼稚型Treg的抑制能力要強于記憶型。
　　 (2)FoxP3gfp小鼠的nTreg的各亞型誘導分化能力分析
　　 當我們將幼稚型和記憶型Treg細胞亞系分選后,進行離體細胞因子誘導分化,發(fā)現(xiàn)幼稚型細胞具有更強的分化潛能。而在我們進行三輪連續(xù)體外激活和細胞因子誘導分化時,幼稚型Treg細胞顯示出更強的向Th17方向分化的能力,并且仍舊

13、保留FoxP3基因的表達。對于Th1和Th2方向的分化,幼稚型和記憶型Treg細胞都表現(xiàn)出不穩(wěn)定性,但是其都能夠向Th1方向大量轉(zhuǎn)化。
　　 (3)乳腺癌患者外周血及TIL中Treg細胞亞型分析
　　 以乳腺癌作為腫瘤疾病模型,我們使用FCM流式細胞術(shù)分析了乳腺癌患者外周血及腫瘤微環(huán)境中提取的TIL含Treg細胞的亞系比例。結(jié)果發(fā)現(xiàn),不論使用CD45RA還是CD62L幼稚型細胞表面標志來區(qū)分Treg,其幼稚型亞系的比例在

14、乳腺癌患者外周血中所占比例要高于健康人對照。在提取的TIL細胞中幼稚型Treg也占到比較大的比重。
　　 結(jié)論與創(chuàng)新:
　　 1.CD4+T細胞敲除Stat3基因后其在小鼠體內(nèi)的發(fā)育與分布不受影響。
　　 2.Stat3基因敲除導致CD4+T細胞向Th17分化受抑,但Th1、Th2、Treg方向的分化不受影響；因而其分泌IL-17a能力下降,但其余多種細胞因子不受明顯影響。
　　 3.Stat3-／-CD

15、4+T細胞在離體TCR受體激活時增殖受抑、凋亡增加；且此種凋亡能夠被泛caspase抑制劑Z-VAD-fmk逆轉(zhuǎn)。
　　 4.此種Stat3基因敲除的CD4+T細胞不能產(chǎn)生有效的抗腫瘤免疫；并經(jīng)過繼免疫治療模型的反復驗證,Stat3-／-CD4+T細胞介導的抗腫瘤免疫能力下降與其TCR激活后凋亡而不能擴增CD8+T細胞有關(guān)。
　　 5.進一步的TCR信號通路和凋亡信號通路的分析表明,TCR受體激活通過ZAP70繼續(xù)激活S

16、tat3磷酸化,進而調(diào)控Bcl-2家族的信號傳導通路受損是Stat3-／-CD4+T細胞不能發(fā)揮正?？鼓[瘤免疫功能的原因。
　　 6.模式動物FoxP3gfp小鼠的nTreg細胞可以通過細胞表面標志分子CD62L／CD44進一步分為幼稚型Treg(CD4+／FoxP3-GFP+／CD62L+／CD44-,na(i)ve Treg)和記憶型Treg細胞(CD4+／FoxP3-GFP+／CD62L-／CD44+,memory Tre

17、g)。
　　 7.經(jīng)MACS、FACS技術(shù)分選后,可以觀察到幼稚型和記憶型Treg確為兩群獨立的細胞,可以進行高純度的分離。
　　 8.在體外免疫抑制功能檢測實驗中,幼稚型Treg顯示出更強的抑制功能。
　　 9.在離體細胞因子誘導分化實驗中,幼稚型Treg顯示出更強的向其他T輔助細胞系轉(zhuǎn)分化的能力。
　　 10.在乳腺癌患者外周血中,CD45RA+的幼稚型Treg和CD62L+的幼稚型Treg在總CD4