類風濕關節(jié)炎CD4+T細胞上CD28的表達與凋亡的相關性研究.pdf

1、背景：類風濕關節(jié)炎(RheumatoidArthritis，RA)是一種常見的以關節(jié)滑膜炎為特征的全身性自身免疫性疾病，呈慢性侵蝕性的炎癥過程，其致殘率高，對病人的心理狀況和生命質量帶來極大的負面影響。研究顯示，免疫系統的所有組成部分均參與介導組織損害和系統炎癥。雖然最突出的免疫病理事件發(fā)生在關節(jié)部位和滑膜中，但免疫異常并不限于滑膜滲出的淋巴細胞的活化和克隆擴增，還包括循環(huán)中大部分的T細胞。T細胞，尤其是CD4+T細胞所介導的自身免疫反

2、應一直被認為在RA的發(fā)病機制中起重要作用。CD28是眾多協同刺激分子中最重要的一個。CD28可與抗原呈遞細胞上的CD80和CD86結合，啟動協同刺激信號，并在提高T淋巴細胞的反應性、誘導抗凋亡基因表達、增加細胞因子的分泌、促進T淋巴細胞與APC的結合和阻止T淋巴細胞的失能(anergy)等方面有著重要的作用。CD28的重要作用提示，通過調節(jié)CD28的表達水平會改變T細胞的功能。近來國外的一些研究發(fā)現，RA患者外周血中存在缺乏CD28表達

3、的CD4+T細胞的擴增和持續(xù)存在。盡管缺乏CD28介導的信號對T細胞刺激的作用，RA患者體內的CD4+CD28-T細胞并非無能。這提示了RA中的CD28-T細胞是一個獨特的細胞群體。對此國內未見相關報道。鑒于T細胞在疾病進程的中心作用及國內研究空白，我們提出這樣的問題：漢族人群的RA患者是否也存在CD4+CD28-T細胞的擴增?若CD4+CD28-T細胞亞群在RA患者體內出現及持續(xù)存在，是否存在凋亡途徑的異常?是否由于該細胞亞群的異常特

4、性從而導致機體的免疫反應轉變參與RA的發(fā)病?CD4+CD28-T細胞亞群是否與疾病的臨床表現、活動度及預后相關?為回答上述問題，我們設立了本研究。 目的：檢測外周血T細胞亞群上CD28分子的表達水平，并通過細胞培養(yǎng)觀察RA患者淋巴細胞對凋亡的易感性及其凋亡相關基因Bcl-2/Bax的表達情況，明確RA患者是否存在CD4+CD28-T細胞擴增及其與外周血淋巴細胞凋亡率的相關性，進一步探討RA患者是否由于大量的CD4+CD28-T細

5、胞的存在導致機體的免疫反應轉變參與發(fā)病，從而深刻影響疾病的臨床表現甚至預后。 材料與方法：根據1987年美國風濕學會(ACR)修訂的診斷標準，將確診為RA的35名患者設為實驗組；30名排除自身免疫性疾病史的健康漢族人作為正常對照組。兩組間性別和年齡無顯著差異。從外周血分離淋巴細胞，一部分直接上流式細胞儀檢測外周血CD4+T細胞上CD28表達情況和早期凋亡率(AnnexinV-FITC/PI雙染色)，一部分細胞予PHA刺激淋巴細胞

6、以誘導淋巴細胞增殖活化，培養(yǎng)24小時后收集細胞采用流式細胞術(AnnexinV-FITC/PI雙染色)和共聚焦顯微鏡(AO/EB雙染色)檢測凋亡率；并進行細胞涂片免疫組化法檢測凋亡相關基因Bcl-2/Bax的表達情況，顯微鏡下觀察、計數。統計學分析：計量資料組間比較根據數據分布類型分別采用獨立樣本t檢驗、非參數Mann-WhitneyU檢驗和Kruskal-Wallis檢驗；不同指標間的相關性用Spearman分析。 結果：

7、 (1)RA組CD4+CD28-T細胞比例的均數明顯高于健康對照組(5.58±6.41％vs1.91±1.48％，P＜0.05)，RF≥100U/ml的患者CD4+CD28-T細胞比例明顯高于RF＜30U/ml和30≤RF＜100U/ml的患者(13.26±7.10％vs4.50±3.03％、1.42±1.62％；p＜0.01)； (2)新鮮分離的淋巴細胞凋亡率兩組間無顯著性差異；予PHA刺激淋巴細胞活化24小時后檢測的凋亡

8、顯示RA組的凋亡率明顯低于對照組(流式細胞術：12.08±6.06％vs18.66±7.27％，p＜0.05；共聚焦顯微鏡：6.14±1.86％vs19.27±3.75％，p＜0.001)，并與DAS28評分呈負相關(r=-0.617，p=0.008)； (3)在PHA刺激下，在RA病人的淋巴細胞中出現Bax表達的免疫陽性細胞計數顯著低于對照組(RA：54.15±4.83％vs對照組：60.26±5.26％，p=0.014)；而

9、Bcl-2免疫陽性細胞計數顯著高于對照組(RA：58.04±4.72％vs對照組：33.60±4.59％，p=0.000)。 (4)在CD4+CD28-T細胞比例與活化淋巴細胞凋亡率之間進行Spearman相關分析，結果顯示它們存在負相關(r=-0.433，p=0.003)； 結論：(1)RA組CD4+CD28-T細胞比例的均數明顯高于健康對照組并與RF滴度間存在一定相關性，提示CD4+CD28-T細胞水平與疾病狀況和慢

10、性炎癥相關。大量的CD4+CD28-T細胞出現可能引導機體的免疫反應轉變從而參與RA的發(fā)病機制。(2)RA病人活化的外周血淋巴細胞出現凋亡缺陷，并與RA病情活動程度相關。對激活誘導凋亡的易感性的降低可能導致活化的外周淋巴淋巴細胞亞群的擴增并因此參與在RA外周自我活化T細胞克隆的維系。(3)在RA病人，發(fā)現活化的外周血淋巴細胞有Bax表達降低和Bcl-2表達增高，提示在RA淋巴細胞抗凋亡進程的發(fā)生以Bcl-2的過度表達和Bax的低表達為特