bcl-2基因轉染和CNTF活性蛋白聯合對家兔RPE細胞凋亡保護作用的實驗研究.pdf

1、第二軍醫(yī)大學碩士學位論文bcl-2基因轉染和CNTF活性蛋白聯合對家兔RPE細胞凋亡保護作用的實驗研究姓名：李素芳申請學位級別：碩士專業(yè)：眼科學指導教師：魏銳利20040501b c l 一2 基因轉染和C N T F 活性蛋白聯合對家兔R P E 細胞凋亡的保護作用的實驗研究中文摘要本文主要研究目的是對b c l 一2 基因轉染和C N T F 活性蛋白聯合對吲哚美辛誘導的家兔視網膜色素上皮細胞( r R P E ) 凋亡的保護作用進

2、行研究。本研究分為三部分。第一部分：家兔R P E 細胞的原代培養(yǎng)首先進行家兔視網膜色素上皮細胞( r R P E ) 的分離、原代培養(yǎng)、傳代及凍存復蘇等，然后通過光學顯微鏡、免疫細胞化學染色法等方法對培養(yǎng)的家兔R P E 細胞進行鑒定。第二部分：b c l - 2 重組逆轉錄病毒的構建、轉染及鑒定首先進行目的基因b c l - 2 和逆轉錄病毒載體行H i n d l I I + S t uI 雙酶切后連接，構建b c l 一2 重組

3、逆轉錄病毒，然后通過I n v i t r o g e nL i p o f e c t a m i n e I ”脂質體轉染法用b c l 一2 重組逆轉錄病毒轉染培養(yǎng)的家兔原代R P E 細胞，G 4 1 8 ( 濃度為2 0 0 ¨g ／m ] ) 篩選出表達b c l 一2 蛋白的家兔R P E 細胞克隆，并使家兔R P E 細胞克隆的大量培養(yǎng)擴增，建立穩(wěn)定表達b c l 一2 蛋白的家兔R P E 細胞株。采用基因測

4、序和P C R 方法對b c l 一2 重組逆轉錄病毒進行鑒定；采用R T ～P C R 和W e s t e r nb l o t t i n g印跡法對穩(wěn)定表達b c l 一2 蛋白的家兔R P E 細胞株進行鑒定。第三部分：家兔R P E 細胞的抗凋亡實驗研究首先用不同梯度濃度( 0 、1 0 0 、2 0 0 、4 0 0 、6 0 0 、8 0 0 和1 0 0 0 p m o l ／L ) 的吲哚美辛( i n d o m

5、e t h a e i n ，I N ) 作用培養(yǎng)的家兔R P E 細胞，篩選出I N 使家兔R P E細胞凋亡的最佳濃度( 2 0 0 um o l ／L ) ，建立家兔R P E 細胞凋亡模型；其次用不同梯度濃度( 0 、1 0 、2 0 、4 0 n g ／m 1 ) 的C N T F 活性蛋白作用家兔R P E 細胞，篩選出有利于家兔R P E 細胞生長的最佳濃度( 2 0 n g ／m 1 ) ：然后用濃度為2 0 0 um