Bcl-2和Inhibinα基因?qū)Z卵泡顆粒細(xì)胞增殖凋亡的影響.pdf

1、為研究Bcl-2和Inhibinα基因?qū)︻w粒細(xì)胞增殖凋亡的作用，構(gòu)建了Bcl-2基因干擾載體(psiRNAb1、psiRNAb2、psiRNAb3)和Inhibinα基因干擾載體(psiRNA-INHα1和psiRNA-INHα2)，利用鵝F1和閉鎖卵泡顆粒細(xì)胞模型研究干擾這兩個(gè)基因后的表型。分別用熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀測(cè)定轉(zhuǎn)染RNA干擾質(zhì)粒48h后的轉(zhuǎn)染效率、Bcl-2和Inhibinα基因表達(dá)水平、細(xì)胞生長(zhǎng)周期、細(xì)胞凋亡指數(shù)(apo

2、ptosisindex，AI)和增殖指數(shù)(proliferationindex，PI)的變化；用放免法測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清中雌二醇和孕酮水平。試驗(yàn)結(jié)果如下： 1.利用Ambion的RNA干擾設(shè)計(jì)軟件，根據(jù)Genbank中已發(fā)表的序列(D11381)針對(duì)Bcl-2基因設(shè)計(jì)三對(duì)干擾序列，并根據(jù)RNAi-ReadypSIREN-RetroQ-ZsGreen載體的特點(diǎn)在設(shè)計(jì)的序列上做了分別命名為psiRNAb1、psiRNAb2、psiRN

3、Ab3。針對(duì)Inhibinα亞基(NM-001031257)設(shè)計(jì)兩對(duì)干擾序列，分別命名為psiRNA-INHα1和psiRNA-INHα2。 2.采用無(wú)血清培養(yǎng)方法體外培養(yǎng)鵝卵泡顆粒細(xì)胞，將本文構(gòu)建的Bcl-2和Inhibinα基因干擾載體脂質(zhì)體包裹轉(zhuǎn)染顆粒細(xì)胞，48h后熒光顯微鏡檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率，干擾組轉(zhuǎn)染效率達(dá)到60％以上。 3.流式細(xì)胞儀檢測(cè)顆粒細(xì)胞中Bcl-2蛋白表達(dá)，3個(gè)干擾組中當(dāng)Bcl-2基因被干擾后顆粒細(xì)胞分泌

4、Bcl-2蛋白明顯降低，且差異顯著，尤其是psiRNAb3組蛋白表達(dá)最低。 4.當(dāng)顆粒細(xì)胞Bcl-2表達(dá)下調(diào)時(shí)，顆粒細(xì)胞增殖指數(shù)明顯上升，且隨Bcl-2表達(dá)量減少而上升，增加的程度與Bcl-2表達(dá)量顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.872，p<0.05)，顆粒細(xì)胞凋亡指數(shù)也明顯上升，增加的程度與Bcl-2表達(dá)減少顯著相關(guān)(r=-0.951，p<0.05)。放免法檢測(cè)Bcl-2基因干擾后顆粒細(xì)胞P分泌水平顯著上升，E2分泌受到抑制。

5、5.閉鎖卵泡顆粒細(xì)胞凋亡比例顯著高于F1卵泡顆粒細(xì)胞，Inhibinα基因干擾后F1和閉鎖卵泡顆粒細(xì)胞抑制素表達(dá)水平比對(duì)照組降低(P<0.05)。 6.當(dāng)顆粒細(xì)胞Inhibinα基因表達(dá)下調(diào)時(shí)，細(xì)胞凋亡指數(shù)和增殖指數(shù)顯著高于對(duì)照組(p<0.05)，細(xì)胞分泌雌激素水平顯著下降(p<0.05)，而細(xì)胞P分泌顯著上升(p<0.05)。 結(jié)果表明: (1)Inhibinα基因干擾后卵泡顆粒細(xì)胞抑制素表達(dá)水平比對(duì)照組顯著降