兩種微生態(tài)學動物模型的建立及其在抗菌藥物殘留安全評估中的應(yīng)用研究.pdf

1、研究發(fā)現(xiàn)人體長期攝入殘留劑量抗菌藥物會對腸道菌群產(chǎn)生不利影響,如破壞腸道菌群定植抗力,誘導及促進耐藥菌的增長等。國際組織、歐美等國家已將抗菌藥物殘留對人體腸道菌群的影響列為安全性評價的一項重要內(nèi)容。我國動物性食品抗菌藥物殘留嚴重,在這種緊迫形勢下,國內(nèi)已經(jīng)積極開展相關(guān)工作。
　　 人腸道菌群定植小鼠模型模擬了人腸道菌群的特性,是抗菌藥物殘留安全性評價中推薦使用的動物模型。然而,該模型以穩(wěn)定的成年人腸道菌群為研究對象,致使其評價結(jié)

2、果不能反映抗菌藥物對脆弱的嬰幼兒腸道菌群的影響。因此,有必要建立敏感動物模型用以評估抗菌藥物對幼年期腸道菌群的影響,幼年小鼠模型則可滿足這一需求。
　　 為適應(yīng)我國抗菌藥物殘留微生物安全評估工作順利開展的需要,本課題擬首先依據(jù)動物模型構(gòu)建的相似性原則,建立人腸道菌群定植小鼠模型,并利用該模型評估恩諾沙星殘留對人體腸道菌群的影響;其次,依據(jù)動物模型構(gòu)建的敏感性原則,利用幼年小鼠模型研究阿莫西林對幼年期腸道菌群正常發(fā)育的長期影響。以

3、上結(jié)果將為我國建立更為科學、全面的抗菌藥物殘留安全性評估體系提供良好動物模型、先進檢測技術(shù)和基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。課題分為二部分:
　　 第一部分
　　 目的:建立HFA-KM小鼠模型,研究該模型腸道菌群與人腸道菌群的相似性,為抗菌藥物殘留微生物學安全評價提供良好的動物模型;評估恩諾沙星殘留對HFA-KM小鼠模型腸道菌群數(shù)量、組成多樣性和耐藥性的影響,為我國抗菌藥物殘留微生物學安全評估工作提供可借鑒的評估模型和技術(shù)。
　　

4、方法:(1)對臨產(chǎn)KM孕鼠進行無菌剖腹產(chǎn)手術(shù),在無菌隔離器內(nèi)對剖出的無菌仔鼠進行人工喂養(yǎng),從而培育無菌KM小鼠。(2)將健康志愿者糞便懸液菌群灌胃接種于無菌KM小鼠腸道,獲得HFA-KM小鼠模型。(3)利用PCR-DGGE技術(shù)分析HFA-KM小鼠腸道菌群總菌及優(yōu)勢種屬-擬桿菌屬的菌群組成與志愿者個體腸道菌群的相似性。(4)通過隨機飲水方式,連續(xù)35d分別給予HFA-KM小鼠高、中、低劑量的恩諾沙星,模擬殘留劑量抗菌藥物的持續(xù)作用,低劑量

5、對應(yīng)于思諾沙星的ADI值。(5)活菌計數(shù)方法研究HFA-KM小鼠腸道菌群數(shù)量和耐藥性的變化、PCR-DGGE技術(shù)研究腸道菌群結(jié)構(gòu)多樣性變化。
　　 結(jié)果:(1)培育出的無菌KM小鼠經(jīng)第三方-中國藥品生物制品檢定所進行無菌檢驗,檢驗結(jié)果為陰性,證明我們培育的小鼠是無菌小鼠,為HFA小鼠模型的建立提供了動物來源。(2)V3-DGGE圖譜及擬桿菌屬DGGE圖譜顯示:盡管兩株毛螺旋菌科(Lachnospiraceae)細菌和一株普通擬桿

6、菌(Bacteriodes vulgatus)不能在HFA小鼠腸道中優(yōu)勢定植,但健康志愿者腸道菌群的優(yōu)勢菌大部分可在HFA小鼠腸道中穩(wěn)定定植,說明本實驗部分建立的HFA小鼠模型的腸道菌群具備了健康志愿者腸道菌群的主要特征。(3)中、高劑量的恩諾沙星在給藥后期能減少HFA-KM小鼠的總需氧菌和腸桿菌數(shù)量,與對照組相比差異顯著(P＜0.05),對其他類群的細菌無顯著作用;低劑量的恩諾沙星對腸道菌群的數(shù)量無顯著影響。(4)中、高劑量的恩諾沙星

7、在給藥后期能增加HFA-KM小鼠的總需氧菌和總厭氧菌的耐藥性,與對照組相比差異顯著(P＜0.05),對其他類群的細菌無顯著作用;低劑量的恩諾沙星對腸道菌群的耐藥性無顯著影響。(5)V3-DGGE圖譜顯示,三個劑量的恩諾沙星均顯著減小HFA-KM小鼠腸道菌群的豐富度和Shannon指數(shù)(P＜0.05)。
　　 第二部分
　　 目的:利用幼年小鼠模型研究阿莫西林對腸道菌群正常發(fā)育的長期影響,尤其是觀察對幼年期腸道優(yōu)勢菌群-乳

8、桿菌和雙歧桿菌多樣性的影響,為探索幼年小鼠模型在抗菌藥物殘留安全性評價中的適用性提供動物實驗數(shù)據(jù)。
　　 方法:(1)7日齡幼年BALB/C仔鼠連續(xù)灌胃14天治療劑量阿莫西林或生理鹽水,于21日齡(灌胃結(jié)束時)和56日齡(結(jié)束后5周)分別處死5只小鼠,無菌采集小鼠結(jié)腸內(nèi)容物。(2)建立BALB/C小鼠腸道乳桿菌群和雙歧桿菌菌群16S rRNA基因克隆文庫。(3)PCR-DGGE技術(shù)分析腸道總菌、乳桿菌及雙歧桿菌菌群結(jié)構(gòu)多樣性變化

9、。(4)實時定量PCR技術(shù)分析乳桿菌屬及雙歧桿菌屬數(shù)量變化。
　　 結(jié)果:(1)BALB/C小鼠腸道乳桿菌菌群和雙歧桿菌菌群結(jié)構(gòu)簡單,腸道乳桿菌菌群的優(yōu)勢菌為L.murinus(61.2％)和L.johnsonii(29.5％),雙歧桿菌菌群的優(yōu)勢菌為B.pseudolongum(88.5％)。(2)阿莫西林作用于幼年小鼠腸道菌群,停藥5周后,小鼠腸道菌群豐富度和Shannon指數(shù)仍顯著低于正常對照(P＜0.05)。具體來說,腸

10、道乳桿菌屬數(shù)量恢復至正常水平,但菌群豐富度和Shannon指數(shù)仍顯著低于正常對照(P＜0.05),典型特征為一株優(yōu)勢菌L.johnsonii不能繼續(xù)定植于小鼠腸道;雙歧桿菌屬數(shù)量顯著低于正常對照(P＜0.05),但對菌群微生物多樣性無顯著影響。
　　 主要結(jié)論:
　　 1.將健康志愿者糞便懸液菌群接種于無菌KM小鼠后獲得HFA-KM小鼠模型。健康志愿者和HFA-KM小鼠的腸道菌群相似性分析結(jié)果表明健康志愿者腸道菌群的優(yōu)勢

11、菌大部分可在HFA-KM小鼠腸道中定植,HFA-KM小鼠模型具備了健康志愿者腸道菌群的主要特征,是抗菌藥物殘留微生物學安全性評價的良好動物模型。
　　 2.對應(yīng)于現(xiàn)行恩諾沙星ADI值的藥物劑量對腸道菌群數(shù)量和耐藥性無顯著影響,但顯著減少了菌群多樣性。從腸道菌群多樣性角度考慮,現(xiàn)行恩諾沙星ADI值的安全性有待進一步檢驗。
　　 3.阿莫西林對幼年小鼠腸道菌群的正常發(fā)育具有長期干擾作用,尤其是乳桿菌屬和雙歧桿菌屬。說明幼年小