沉默p75NTR基因促進(jìn)舌鱗癌細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制研究.pdf

1、口腔頜面部最常見(jiàn)的惡性腫瘤是口腔鱗狀細(xì)胞癌(oralsquamouscellcarcinoma,OSCC)，大約占口腔惡性腫瘤的80％以上，舌部又是口腔鱗狀細(xì)胞癌最多發(fā)生的器官?？谇击[狀細(xì)胞癌和其他惡性腫瘤一樣其主要特點(diǎn)是復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，而腫瘤的無(wú)限增殖又是復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)。目前，以根治腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，尋找靶向腫瘤干細(xì)胞的抗癌策略，已成為許多腫瘤研究學(xué)者研究熱點(diǎn)。腫瘤干細(xì)胞(cancerstemcells，CSC)理論的提出，我們對(duì)腫瘤的

2、認(rèn)識(shí)及治療進(jìn)入了一個(gè)全新的領(lǐng)域，并推翻了以往對(duì)癌癥治療的基本原則。越來(lái)越多的有關(guān)基因治療腫瘤方面的研究成果充分說(shuō)明，針對(duì)特殊基因來(lái)治療惡性腫瘤有十分好的應(yīng)用前景。RNA干擾技術(shù)即為此領(lǐng)域研究的突出成果之一，研究者針對(duì)特殊基因來(lái)治療惡性腫瘤以達(dá)到合成對(duì)應(yīng)siRNA片段的藥物，用于腫瘤的基因治療。
　　 p75NTR(p75NTRneurotrophinreceptr)低親和力神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子受體(LNTFR)是分子量為75KDa的細(xì)胞

3、表面受體糖蛋白。p75NTR在多種系統(tǒng)腫瘤中的陽(yáng)性表達(dá)已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)和證實(shí)。其陽(yáng)性表達(dá)量及p75NTR陽(yáng)性細(xì)胞的侵襲特性與腫瘤預(yù)后有著密切的聯(lián)系，多數(shù)學(xué)者已將p75NTR列為評(píng)估腫瘤預(yù)后的診斷指標(biāo)。我們通過(guò)前期的研究發(fā)現(xiàn)，p75NTR在口腔舌鱗狀細(xì)胞癌中都有陽(yáng)性表達(dá)，并證實(shí)p75NTR陽(yáng)性細(xì)胞具有干細(xì)胞增生分化的特性。因此有必要進(jìn)一步研究p75NTR在舌鱗癌細(xì)胞增生或凋亡中的作用及其作用機(jī)制，特別是在分子水平研究p75NTR誘導(dǎo)舌鱗癌細(xì)胞增

4、生或凋亡的分子機(jī)制，發(fā)現(xiàn)p75NTR誘導(dǎo)舌癌細(xì)胞凋亡通路，描繪凋亡通路的一系列化學(xué)反應(yīng)，明確p75NTR在這一系列化學(xué)反應(yīng)鏈條中的位置及其上下游反應(yīng)的銜接因子，這將會(huì)為徹底根治舌癌，尋找靶向腫瘤干細(xì)胞的抗癌藥物具有重要的意義。
　　 目的：
　　 在生物學(xué)分子水平探求p75NTR介導(dǎo)口腔舌鱗癌細(xì)胞凋亡或增生可能的分子機(jī)制通路，為針對(duì)特殊基因來(lái)治療舌鱗癌，尋找靶向腫瘤干細(xì)胞的抗癌藥物提供可能的理論依據(jù)。
　　 方法

5、：
　　 1.舌鱗癌細(xì)胞的培養(yǎng)及p75NTR陽(yáng)性細(xì)胞分選
　　 RPMI-1640培養(yǎng)基，在37℃、5％CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)舌癌細(xì)胞系Tca8113細(xì)胞。采用流式細(xì)胞分選技術(shù)于Tca8113鱗癌細(xì)胞中分選出p75NTR陽(yáng)性細(xì)胞，倒置顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞的形態(tài)及活性情況。
　　 2.采用siRNA干擾技術(shù)下調(diào)p75NTR蛋白在舌鱗癌細(xì)胞的表達(dá)
　　 根據(jù)人p75NTR基因（CD271GenBankA

6、ccessionNumber:NM-002507）的序列，共選擇2個(gè)位點(diǎn)設(shè)siRNA。將分選培養(yǎng)的p75NTR陽(yáng)性細(xì)胞分為空白組、陰性組和實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行siRNA轉(zhuǎn)染，48h后采用流式細(xì)胞儀測(cè)定轉(zhuǎn)染效率;然后采用流式細(xì)胞儀AnnexinV/PI雙染色標(biāo)記法檢測(cè)各組舌鱗癌細(xì)胞凋亡的變化;最后應(yīng)用realtime-PCR檢測(cè)各組p75NTRmRNA的干擾效果，并用westernblot技術(shù)檢測(cè)p75NTR蛋白表達(dá)。
　　 3.weste

7、rnblot檢測(cè)轉(zhuǎn)染后各組舌鱗癌細(xì)胞BcL-2基因蛋白的表達(dá)變化。
　　 4.細(xì)胞免疫熒光標(biāo)記法觀(guān)察核內(nèi)因子NF-κB在細(xì)胞內(nèi)的分布特點(diǎn)。
　　 結(jié)果：
　　 1.成功下調(diào)p75NTR蛋白表達(dá)以后實(shí)驗(yàn)組的鱗癌細(xì)胞凋亡率比對(duì)照組的舌鱗癌細(xì)胞的凋亡率明顯增加，反向表明p75NTR有促進(jìn)舌鱗癌細(xì)胞增殖的功能。
　　 2.通過(guò)細(xì)胞免疫熒光法觀(guān)察發(fā)現(xiàn)NF-κB在對(duì)照組細(xì)胞質(zhì)內(nèi)分布較少，細(xì)胞核內(nèi)較多，而實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞質(zhì)內(nèi)

8、NF-κB明顯多，細(xì)胞核內(nèi)NF-κB少。
　　 3.Westernblot方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)組舌鱗癌細(xì)胞凋亡增加時(shí)BcL-2表達(dá)增加。
　　 結(jié)論：
　　 1.p75NTR能促進(jìn)舌鱗癌細(xì)胞增生分化或抗凋亡作用，p75NTR在舌鱗癌細(xì)胞中有著“正向”的生物效應(yīng)。
　　 2.p75NTR促進(jìn)舌鱗癌細(xì)胞增生分化或抗凋亡的分子機(jī)制可能是通過(guò)激活NF-κB通路實(shí)現(xiàn)的。
　　 3.下調(diào)p75NTR引起舌鱗癌細(xì)