恥垢分枝桿菌MSMEG_1401基因的克隆、表達及其對細胞壁多糖代謝的影響.pdf_第1頁
已閱讀1頁,還剩51頁未讀, 繼續(xù)免費閱讀

下載本文檔

版權(quán)說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請進行舉報或認領(lǐng)

文檔簡介

1、結(jié)核?。═uberculosis,TB)是一種古老的且嚴重危害人類健康的疾病,也是全球關(guān)注的公共衛(wèi)生問題和社會問題。結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)是引起結(jié)核病的病原體。由于耐多藥菌株的出現(xiàn)和HIV(Human Immunodeficiency Virus)的協(xié)同作用,使得一度被控制的結(jié)核病的發(fā)病率在全球范圍內(nèi)顯著回升,因此,尋找新一代抗結(jié)核藥物已迫在眉睫。 結(jié)核分枝桿菌細胞壁是細菌特有的、賴

2、以生存的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。其核心結(jié)構(gòu)由最內(nèi)層的肽聚糖(Peptidoglycan,PG)、中間層的聚阿拉伯糖半乳糖(Aribinangalactan,AG)以及最外層的分枝菌酸(Mycolic acid)所構(gòu)成。聚阿拉伯糖半乳糖為連接肽聚糖和分枝菌酸、維持細胞壁結(jié)構(gòu)完整性的重要組分,所以可作為研發(fā)新一代抗結(jié)核藥物的理想靶標。而通過闡明現(xiàn)有藥物的作用機制可以發(fā)現(xiàn)相關(guān)代謝中的關(guān)鍵蛋白并將其確定為潛在的藥物靶點。 抗結(jié)核的一線藥物之一乙胺丁醇

3、(Ethambutol,EMB)是抑菌劑,對細胞外繁殖期的結(jié)核分枝桿菌的生長有抑制作用,且不表現(xiàn)出明顯的耐藥性。美國科羅拉多州立大學(xué)微生物系Mike McNeil教授的一項實驗結(jié)果顯示,在結(jié)核分枝桿菌的培養(yǎng)基中加入乙胺丁醇后,細胞壁中的聚阿拉伯糖在短時間內(nèi)大量流失,使得細菌表面的阿拉伯糖和半乳糖的含量比例發(fā)生明顯改變,為了尋找EMB的作用機制以及與細胞壁表面多糖代謝變化的關(guān)系,前期本研究室的湛垚垚博士用雙向電泳和質(zhì)譜的方法找出了 EMB

4、作用于恥垢分枝桿菌(Mycobacterium smegmatis,M.smegmatis)(因具有與M.tuberculosis相似的細胞壁結(jié)構(gòu)且生長迅速,無病原性,而被用作M.tuberculosis的模式菌)前后的蛋白表達差異點。 本論文的實驗?zāi)康模焊鶕?jù)本研究室湛垚垚博士的雙向電泳和質(zhì)譜結(jié)果,在NCBI基因數(shù)據(jù)庫中尋找相關(guān)蛋白的基因序列,設(shè)計引物,采用RT-PCR(reverse transcriptase polymer

5、ase chain reaction,逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng))的方法來檢測EMB作用前后蛋白表達差異點所對應(yīng)的基因的表達變化情況。如表達水平增高非常明顯,則我們對相應(yīng)基因在恥垢分枝桿菌中進行克隆表達,人為地提高相關(guān)基因的表達水平,最終用HPLC(high performance liquid chromatography,高效液相色譜)的方法檢測細胞壁阿拉伯糖(Arabinose,Ara)和半乳糖(Galactose,Gal)的含量比例變化

6、,如阿拉伯糖的比例降低,則說明所研究的基因與細胞壁多糖的代謝密切相關(guān),為后續(xù)更深一步的探討研究提供實驗基礎(chǔ)。 本論文的實驗內(nèi)容及結(jié)果: 1.篩選目的基因; 根據(jù)湛垚垚的質(zhì)譜結(jié)果,對EMB作用前后表達變化差異性顯著的蛋白在NCBI蛋白和基因數(shù)據(jù)庫中尋其相對應(yīng)的基因序列,設(shè)計引物,進行RT-PCR,最終選擇了12個基因進行逆轉(zhuǎn)錄PCR實驗,其中accA(MSMEG_0334,乙酰輔酶A羧化酶a亞基)、tpx(MSME

7、G_3479,巰基過氧化物酶)、tuf(MSMEG_1401,細菌翻譯延長因子Tu)、bfr(MSMEG_3564,細菌鐵蛋白)四種基因表達上調(diào);groEL(MSMEG_0880,伴侶蛋白)、cys(MSMEG_4190,肌醇單磷酸酶家族蛋白)、mtrA(MSMEG_1874,DNA結(jié)合反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白)、hisA(MSMEG_3209,組氨酸合成異構(gòu)酶)、fdxA(MSMEG_1125,轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白)、gpd(MSMEG_0777,依賴F

8、420的六磷酸葡萄糖脫氫酶)、gk(MSMEG_6759,甘油激酶)、pst(MSMEG_5782,磷脂酸鹽特異性轉(zhuǎn)運系統(tǒng)蛋白)八種基因表達下調(diào)。根據(jù)Labworks凝膠成像分析系統(tǒng)分析的結(jié)果,我們選擇表達上調(diào)最為顯著的tuf基因作為目的基因進行克隆和表達。 2.利用PCR方法擴增出正確的目的MSMEG_1401基因; 從NCBI基因數(shù)據(jù)庫中獲得mc2155菌株的MSMEG_1401基因核苷酸序列(1191bp)。根據(jù)其

9、核苷酸序列設(shè)計一對PCR引物,并在上游引物和下游引物的5’端分別引入了Ndel和HindⅢ限制性內(nèi)切酶位點。以便將MSMEG_1401基因連接到pVV2表達載體的Ndel和HindⅢ位點。用具高保真性的LA Taq DNA聚合酶,以mc2155菌株基因組DNA為模板成功擴增了MSMEG_1401基因。 3.克隆MSMEG_1401基因及核昔酸序列測定; 將上述PCR產(chǎn)物連接到克隆載體pMD18-T的EcoRV位點,將連接

10、產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌NovaBlue菌株的感受態(tài)細胞中。經(jīng)過藍百斑篩選然后再用限制性內(nèi)切酶酶切方法篩選出陽性重組質(zhì)粒pMD18-MSMEG1401。對MSMEG_1401基因進行DNA序列測定,測序結(jié)果與恥垢分枝桿菌mc2155菌株基因組數(shù)據(jù)庫中的MSMEG_1401基因序列完全一致,表明用PCR技術(shù)擴增的MSMEG_1401基因不存在任何堿基突變。 4.表達載體pVV2-MSMEG1401的構(gòu)建; 用Ndel和HindⅢ

11、雙酶切pMD18-MSMEG1401陽性重組質(zhì)粒,回收與純化MSMEG_1401基因后,將MSMEG_1401基因連接到表達載體pVV2的NdeⅠ和HindⅢ位點,并用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化NovaBlue感受態(tài)細胞,用BamHⅠ和KpnⅠ雙酶切方法,鑒定重組表達載體pVV2-MSMEG1401。表達載體中的MSMEG_1401基因產(chǎn)物的N端與pVV2表達載體上的6個連續(xù)組氨酸標記形成融合蛋白,便于目的蛋白的檢測。 5.MSMEG_140

12、1目的蛋白在恥垢分枝桿菌中的表達; 將表達質(zhì)粒pVV2-MSMEG1401電轉(zhuǎn)化到恥垢分枝桿菌mc2155菌株中,在37℃條件下表達目的蛋白。用SDS-PAGE電泳和Western blotting方法檢測和鑒定目的蛋白的表達情況。 6.用高效液相色譜法檢測細胞壁阿拉伯糖和半乳糖的含量比例變化 提取野生型和高表達MSMEG_1401蛋白的M.smegmatis mc2155菌株的細胞壁多糖,制備阿拉伯糖和半乳糖的

13、單糖,在一定色譜條件下,根據(jù)提取樣品相應(yīng)各組分的出峰面積大小來比較野生型和高表達MSMEG1401蛋白的M.smegmatis mc2155菌株的細胞壁阿拉伯糖和半乳糖的含量比例變化。 結(jié)論: 本課題利用分子克隆技術(shù)克隆了恥垢分枝桿菌的MSMEG_1401基因,并在恥垢分枝桿菌mc2155中高表達出MSMEG_1401目的蛋白。最終用HPLC的方法檢驗了MSMEG_1401蛋白是否與細胞壁多糖的代謝密切相關(guān),為后期更進一

溫馨提示

  • 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
  • 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
  • 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內(nèi)容里面會有圖紙預(yù)覽,若沒有圖紙預(yù)覽就沒有圖紙。
  • 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
  • 5. 眾賞文庫僅提供信息存儲空間,僅對用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護處理,對用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內(nèi)容負責。
  • 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當內(nèi)容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
  • 7. 本站不保證下載資源的準確性、安全性和完整性, 同時也不承擔用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。

最新文檔

評論

0/150

提交評論