恥垢分枝桿菌MSMEG_1401基因的克隆、表達(dá)及其對(duì)細(xì)胞壁多糖代謝的影響.pdf

1、結(jié)核病（Tuberculosis，TB）是一種古老的且嚴(yán)重危害人類健康的疾病，也是全球關(guān)注的公共衛(wèi)生問(wèn)題和社會(huì)問(wèn)題。結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis）是引起結(jié)核病的病原體。由于耐多藥菌株的出現(xiàn)和HIV（Human Immunodeficiency Virus）的協(xié)同作用，使得一度被控制的結(jié)核病的發(fā)病率在全球范圍內(nèi)顯著回升，因此，尋找新一代抗結(jié)核藥物已迫在眉睫。 結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞壁是細(xì)菌特有的、賴

2、以生存的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。其核心結(jié)構(gòu)由最內(nèi)層的肽聚糖（Peptidoglycan，PG）、中間層的聚阿拉伯糖半乳糖（Aribinangalactan，AG）以及最外層的分枝菌酸（Mycolic acid）所構(gòu)成。聚阿拉伯糖半乳糖為連接肽聚糖和分枝菌酸、維持細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)完整性的重要組分，所以可作為研發(fā)新一代抗結(jié)核藥物的理想靶標(biāo)。而通過(guò)闡明現(xiàn)有藥物的作用機(jī)制可以發(fā)現(xiàn)相關(guān)代謝中的關(guān)鍵蛋白并將其確定為潛在的藥物靶點(diǎn)。 抗結(jié)核的一線藥物之一乙胺丁醇

3、（Ethambutol，EMB）是抑菌劑，對(duì)細(xì)胞外繁殖期的結(jié)核分枝桿菌的生長(zhǎng)有抑制作用，且不表現(xiàn)出明顯的耐藥性。美國(guó)科羅拉多州立大學(xué)微生物系Mike McNeil教授的一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在結(jié)核分枝桿菌的培養(yǎng)基中加入乙胺丁醇后，細(xì)胞壁中的聚阿拉伯糖在短時(shí)間內(nèi)大量流失，使得細(xì)菌表面的阿拉伯糖和半乳糖的含量比例發(fā)生明顯改變，為了尋找EMB的作用機(jī)制以及與細(xì)胞壁表面多糖代謝變化的關(guān)系，前期本研究室的湛垚垚博士用雙向電泳和質(zhì)譜的方法找出了 EMB

4、作用于恥垢分枝桿菌（Mycobacterium smegmatis，M．smegmatis）（因具有與M．tuberculosis相似的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)且生長(zhǎng)迅速，無(wú)病原性，而被用作M．tuberculosis的模式菌）前后的蛋白表達(dá)差異點(diǎn)。 本論文的實(shí)驗(yàn)?zāi)康模焊鶕?jù)本研究室湛垚垚博士的雙向電泳和質(zhì)譜結(jié)果，在NCBI基因數(shù)據(jù)庫(kù)中尋找相關(guān)蛋白的基因序列，設(shè)計(jì)引物，采用RT-PCR（reverse transcriptase polymer

5、ase chain reaction，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)）的方法來(lái)檢測(cè)EMB作用前后蛋白表達(dá)差異點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的基因的表達(dá)變化情況。如表達(dá)水平增高非常明顯，則我們對(duì)相應(yīng)基因在恥垢分枝桿菌中進(jìn)行克隆表達(dá)，人為地提高相關(guān)基因的表達(dá)水平，最終用HPLC（high performance liquid chromatography，高效液相色譜）的方法檢測(cè)細(xì)胞壁阿拉伯糖（Arabinose，Ara）和半乳糖（Galactose，Gal）的含量比例變化

6、，如阿拉伯糖的比例降低，則說(shuō)明所研究的基因與細(xì)胞壁多糖的代謝密切相關(guān)，為后續(xù)更深一步的探討研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 本論文的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容及結(jié)果： 1．篩選目的基因; 根據(jù)湛垚垚的質(zhì)譜結(jié)果，對(duì)EMB作用前后表達(dá)變化差異性顯著的蛋白在NCBI蛋白和基因數(shù)據(jù)庫(kù)中尋其相對(duì)應(yīng)的基因序列，設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行RT-PCR，最終選擇了12個(gè)基因進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄PCR實(shí)驗(yàn)，其中accA（MSMEG_0334，乙酰輔酶A羧化酶a亞基）、tpx（MSME

7、G_3479，巰基過(guò)氧化物酶）、tuf（MSMEG_1401，細(xì)菌翻譯延長(zhǎng)因子Tu）、bfr（MSMEG_3564，細(xì)菌鐵蛋白）四種基因表達(dá)上調(diào)；groEL（MSMEG_0880，伴侶蛋白）、cys（MSMEG_4190，肌醇單磷酸酶家族蛋白）、mtrA（MSMEG_1874，DNA結(jié)合反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白）、hisA（MSMEG_3209，組氨酸合成異構(gòu)酶）、fdxA（MSMEG_1125，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白）、gpd（MSMEG_0777，依賴F

8、420的六磷酸葡萄糖脫氫酶）、gk（MSMEG_6759，甘油激酶）、pst（MSMEG_5782，磷脂酸鹽特異性轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)蛋白）八種基因表達(dá)下調(diào)。根據(jù)Labworks凝膠成像分析系統(tǒng)分析的結(jié)果，我們選擇表達(dá)上調(diào)最為顯著的tuf基因作為目的基因進(jìn)行克隆和表達(dá)。 2．利用PCR方法擴(kuò)增出正確的目的MSMEG_1401基因; 從NCBI基因數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得mc2155菌株的MSMEG_1401基因核苷酸序列（1191bp）。根據(jù)其

9、核苷酸序列設(shè)計(jì)一對(duì)PCR引物，并在上游引物和下游引物的5’端分別引入了Ndel和HindⅢ限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。以便將MSMEG_1401基因連接到pVV2表達(dá)載體的Ndel和HindⅢ位點(diǎn)。用具高保真性的LA Taq DNA聚合酶，以mc2155菌株基因組DNA為模板成功擴(kuò)增了MSMEG_1401基因。 3．克隆MSMEG_1401基因及核昔酸序列測(cè)定; 將上述PCR產(chǎn)物連接到克隆載體pMD18-T的EcoRV位點(diǎn)，將連接

10、產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌NovaBlue菌株的感受態(tài)細(xì)胞中。經(jīng)過(guò)藍(lán)百斑篩選然后再用限制性內(nèi)切酶酶切方法篩選出陽(yáng)性重組質(zhì)粒pMD18-MSMEG1401。對(duì)MSMEG_1401基因進(jìn)行DNA序列測(cè)定，測(cè)序結(jié)果與恥垢分枝桿菌mc2155菌株基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中的MSMEG_1401基因序列完全一致，表明用PCR技術(shù)擴(kuò)增的MSMEG_1401基因不存在任何堿基突變。 4．表達(dá)載體pVV2-MSMEG1401的構(gòu)建; 用Ndel和HindⅢ

11、雙酶切pMD18-MSMEG1401陽(yáng)性重組質(zhì)粒，回收與純化MSMEG_1401基因后，將MSMEG_1401基因連接到表達(dá)載體pVV2的NdeⅠ和HindⅢ位點(diǎn)，并用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化NovaBlue感受態(tài)細(xì)胞，用BamHⅠ和KpnⅠ雙酶切方法，鑒定重組表達(dá)載體pVV2-MSMEG1401。表達(dá)載體中的MSMEG_1401基因產(chǎn)物的N端與pVV2表達(dá)載體上的6個(gè)連續(xù)組氨酸標(biāo)記形成融合蛋白，便于目的蛋白的檢測(cè)。 5．MSMEG_140

12、1目的蛋白在恥垢分枝桿菌中的表達(dá); 將表達(dá)質(zhì)粒pVV2-MSMEG1401電轉(zhuǎn)化到恥垢分枝桿菌mc2155菌株中，在37℃條件下表達(dá)目的蛋白。用SDS-PAGE電泳和Western blotting方法檢測(cè)和鑒定目的蛋白的表達(dá)情況。 6．用高效液相色譜法檢測(cè)細(xì)胞壁阿拉伯糖和半乳糖的含量比例變化 提取野生型和高表達(dá)MSMEG_1401蛋白的M．smegmatis mc2155菌株的細(xì)胞壁多糖，制備阿拉伯糖和半乳糖的

13、單糖，在一定色譜條件下，根據(jù)提取樣品相應(yīng)各組分的出峰面積大小來(lái)比較野生型和高表達(dá)MSMEG1401蛋白的M．smegmatis mc2155菌株的細(xì)胞壁阿拉伯糖和半乳糖的含量比例變化。 結(jié)論： 本課題利用分子克隆技術(shù)克隆了恥垢分枝桿菌的MSMEG_1401基因，并在恥垢分枝桿菌mc2155中高表達(dá)出MSMEG_1401目的蛋白。最終用HPLC的方法檢驗(yàn)了MSMEG_1401蛋白是否與細(xì)胞壁多糖的代謝密切相關(guān)，為后期更進(jìn)一